【专家视点】抗HBV药物靶位的研究进展
作者 中国人民解放军第302医院 徐东平 姚伟明
目前临床上应用的抗HBV治疗药物主要有两类：干扰素和核苷（酸）类似物，前者不良反应较大，后者存在病毒耐药问题。抗HBV药物最大的问题是大多数患者在长期治疗后仍不能彻底清除病毒。因此，研发针对HBV不同靶位的新药对慢性HBV感染性疾病的治疗意义重大。本文就抗HBV药物靶位的研究进展进行综述。
全世界约有3.5亿例慢性HBV感染者，其中我国有9300万例，包括2000万例慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)患者。CHB可进展为肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌，每年全世界有近100万人死于CHB相关疾病。尽管预防性疫苗已问世多年，降低了HBV感染率，但现阶段仍有大量的慢性HBV感染者须要进行抗病毒治疗。目前临床应用的抗HBV药物主要分为干扰素(interferon，IFN)和核苷（酸）类似物两大类，前者兼具诱导抗病毒蛋白产生和免疫调节的作用，但治疗成本较高，不良反应较大；后者则通过抑制病毒多聚酶/反转录酶功能，能有效降低血清病毒载量，但长期用药可导致耐药突变株的出现，且对病毒复制的原始模板共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA，cccDNA)无直接抑制作用。两类药物的共同问题是HBsAg清除率低，分别大约为10%和5%,大多数患者即使经过长期抗病毒治疗也难以清除病毒，停药后复发率较高。借鉴 抗HIV和抗HCV药物治疗经验，要显著提高抗HBV疗效乃至根治HBV感染，需要多靶位药物联合治疗，药物作用靶位将针对HBV生命周期中的各个关键环节（包括病毒分子及其与宿主结合作用的关键分子）以及提高机体抗HBV免疫应答能力。
1. HBV感染的生命周期
HBV经与受体结合进入肝细胞后脱去衣壳，病毒DNA进入肝细胞核，在DNA聚合酶等的作用下形成cccDNA，转录成3个短的信使RNA，编码3种表面蛋白和1个长的前基因组RNA (pgRNA)，除编码核心抗原、e抗原和反转录酶外，pgRNA还作为病毒反转录模板，反转录为负链DNA，进而合成正链DNA，形成含有rcDNA的成熟核心颗粒。成熟核心颗粒在细胞质中裹上包膜蛋白成为成熟病毒体释放至肝细胞外，部分可再次入胞核补充cccDNA。
2. 抗HBV药物作用靶位
2.1 针对病毒入胞 阻止病毒入胞是预防病毒感染和防止病毒感染后肝内扩散的一种重要手段，也是抗病毒治疗的一个重要靶点。病毒进入肝细胞内之前，有一个黏附过程，有报道称HBV最初的黏附过程与肝细胞相关的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的糖侧链存在相关性，进一步研究显示病毒通过包膜蛋白抗原环硫酸乙酰肝素结合位点与肝细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖静电结合，随着聚集病毒颗粒的增加而二者的亲和力增强，进而介导病毒入胞。Krepstakies等研究发现能结合硫酸乙酰肝素的人工合成抗脂多糖肽端可以抑制HIV、HSV、HBV和HCV等包膜病毒进入相应的宿主，耐受性好，不良反应少。Florian等研究发现人乳铁蛋白衍生肽段1-23包含GRRRR阳离子簇，可中和病毒包膜表面带负电的氨基酸残基而阻止HBV的黏附和侵入。有研究发现肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)是HBV和HDV的功能性受体，介导HBV入胞，后续进一步研究将鼠NTCP84-87位氨基酸替换成相应人NTCP氨基酸序列或将表达人NCTP的载体转染入细胞系，发现这些原来不感染HBV的动物或细胞系均能感染HBV，证实了NCTP受体在介导HBV入胞过程中的重要性。然而其潜在的靶向抗病毒治疗药物开发意义还有待更深入的阐明。Volz等则利用人源化小鼠证实了来自于HBV大表面蛋白，有47个氨基酸其中N端十四酰化，且具有肝细胞特异性可选择性结合于肝细胞上HBV-preSl特异性受体的肽段Myrcludex-B不仅能有效阻止HBV在感染肝脏内肝细胞间的扩散，而且能抑制最初感染的肝细胞内病毒cccDNA储存库的扩增。因此研发病毒侵入抑制剂，使之与现有的抗病毒药物联用，有可能显著提高疗效。
2.2 针对cccDNA的形成 HBV cccDNA能以游离基因形式独立稳定储存于肝细胞核内，在HBV感染慢性化和肝炎复发中具有重要作用，因而阻止cccDNA形成和十分关键。Belloni等在细胞及动物水平上证明了IFN α通过表观抑制cccDNA的转录活性而发挥其抗HBV作用。宿主抗病毒机制中活化诱导的胞嘧啶脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase，AID)能将外源病毒DNA上胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶，从而使病毒复制力降低，达到抑制复制甚至清除病毒的目的，然而宿主体内自生碱基切除修复系统中尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase，UNG)能切除突变DNA中的尿嘧啶恢复或部分恢复病毒受损的复制力。Kitamura等应用UNG抑制剂于能表达AID的体外肝癌细胞系，使病毒cccDNA上大量胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶，导致病毒P区开放阅读框产生大量终止密码子，从而增强AID介导的抗病毒活性，降低胞内RC-DNA、pre-C mRNA及胞外病毒颗粒分泌水平。Bloom等在体外HepG2.2.15细胞系和高压水动力注射HBV表达载体小鼠模型上，证实了靶向针对HBV开放阅读框定点区域而设计的转录激活剂样效应剂核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)，可有效破坏HBV cccDNA上相应序列，降低病毒复制力。Chen等进一步研究证实TALENs与IFN α联用于高压水动力注射HBV表达载体小鼠模型上时有明显的协同作用。Park等研究发现短发夹RNA (short hairpin RNA，shRNA)可通过诱导HBV cccDNA甲基化而降低其转录活性，起到抗病毒作用。Cai等研究发现磺胺类替代物CCC-0975和CCC-0346可抑制病毒RC-DNA转化成cccDNA，从而抑制cccDNA的形成，发挥抗病毒活性。以上研究在一定程度上证明了以cccDNA为靶点开发根治性药物的可行性。
2.3 针对前基因组包裹和核衣壳装配 研究发现非核苷HBV抑制剂芳基丙烯酰胺衍生物AT-130能够阻止前基因组RNA装配成病毒颗粒及核衣壳的成熟，具有高度选择性，从而有效抑制HBV在人肝癌细胞株中的复制。进一步研究发现耐拉米夫定病毒株和耐阿德福韦病毒株对这个化合物也同样敏感。另一类非核苷HBV抑制剂杂芳基二氢化合物Bay 41-4109在人肝癌细胞株的体外实验研究中被发现能够干扰病毒衣壳蛋白的组装，促进核衣壳蛋白的解聚而发挥强效的抗HBV作用，且细胞毒性低。在人源化Alb-uPA/SCID小鼠模型上B rezillon等证实Bay 41-4109能有效降低模型组小鼠血清中HBV DNA载量，发挥抗病毒作用。进而有研究表明，针对该靶位的化合物GLS4具有更强的抑制HBV DNA复制活性。
2.4 针对DNA合成 目前批准用于治疗CHB患者的核苷（酸）类似物主要有5种，即拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定和替诺福韦酯，此外，恩曲他滨在有的国家也被批准上市应用。核苷（酸）类似物主要通过抑制病毒反转录酶而降低病毒复制水平，其抗病毒效能各有差异，其中替诺福韦酯和恩替卡韦均属强效、高基因屏障药物，病毒学应答率高，为临床一线抗HBV用药。但核苷（酸）类药物不能直接作用于HBV复制的原始模板cccDNA，难以彻底清除病毒。
2.5 针对病毒形态发生与释放 HBV的形态发生和释放同样可以作为抗病毒的新靶点。3种HBV胞膜蛋白（S，M和L蛋白）在内质网中合成，且有着复杂的拓扑结构，它们不仅参与病毒成熟核心颗粒的包膜化过程，还与成熟病毒的释放有关。有研究发现，N-丁基脱氧野艽霉素可抑制包膜蛋白糖基化修饰过程中的葡萄糖苷酶，从而导致HBV包膜蛋白的错误折叠，进而抑制病毒颗粒的组装和释放。Abdul等研究证明阳离子细胞穿透肽可以造成包膜蛋白成簇聚集，影响核心颗粒的包被，从而阻止病毒的释放。
2.6 针对HBx蛋白 HBx蛋白有反式激活作用，可促进病毒自身基因表达，对HBV的复制和转录以及HBV感染慢性化维持有重要的调控作用。因此，HBx蛋白也可作为抗病毒药物开发的新靶点。Xie等和Li等将能表达靶向针对HBx基因的小干扰RNA (smallinterfering RNAs，siRNAs)分别转染入HepG2.2.15细胞和注射入HBV动物模型，研究发现siRNA可明显抑制HBV DNA复制和表达。通过2'，4'-BNA/L.NA化学修饰的siRNA，具有水溶性强、易入胞且对胞内核酸酶抵抗的特点，显著提高了抗HBV活性，延长了作用半寿期。
3. 中草药
传统中药(TCMs)在治疗中国乙型肝炎患者中起到了不可替代的作用，近年来也受到了世界的广泛关注。多种中草药及其活性成分均有强效的抗病毒活性。例如有研究表明汉黄芩素可抑制HBV与宿主肝细胞的细胞融合（阻断病毒侵入与释放），同时具有抑制HBV反转录酶的活性及HBsAg、HBcAg和HBeAg盼表达；氧化苦参碱可以通过下调HBV DNA复制所需的热休克蛋白70而抑制HBV复制，对拉米夫定耐药或不耐药初治患者疗效类似，联合拉米夫定治疗时有协同作用，且能降低CHB患者拉米夫定耐药突变发生率。但也有一些研究提出TCMs的抗HBV疗效不确切。TCMs在标准化生产、活性成分鉴定以及临床随机对照研究方面还须进一步完善。
4. 其他
机体的免疫力（包括天然免疫和特异性免疫）在控制HBV感染中具有重要作用，因此，提高机体免疫力也是研发抗HBV药物的一个策略。Lanford等在鸭肝模型上研究证实短期口服Toll样受体-7激动剂GS-9620可通过增加IFN α细胞因子及趋化因子表达、促进IFN活化诱导基因表达和增强自然杀伤细胞对HBV感染细胞的清除能力，显著降低血清HBV DNA和抗原水平。有研究表明CHB患者由于肝脏内缺陷的抗原递呈系统使大部分T淋巴细胞处于无功能状态，促凋亡分子BIM表达增多介导特异CD8+T淋巴细胞凋亡，共刺激分子如程序性死亡分子(program death，PD)-1和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)相关抗原4(CTL-associated antigen-4，CTLA-4)表达增加，驱使T淋巴细胞功能丧失，以上证据均表明CHB患者特异性免疫力处于“耗竭”状态，白细胞介素(interleukin，11) -12可通过提供CD8+T淋巴细胞活化所需的第三信号而修复CHB患者缺陷的T淋巴细胞，增强其细胞毒性作用及分泌抗病毒相关细胞因子能力。此外，IL-21在小鼠模型上显示出具有抗HBV活性；重组IL-7 (CYT107)联用替诺福韦酯/恩替卡韦治疗CHB已获准进行1/2a临床试验。提高抗HBV特异性免疫应答的新疗法主要包括治疗性疫苗、树突状细胞疫苗、转T细胞受体表达特异性CTL过继免疫疗法、抗PD-L1和抗CTLA-4抗体阻断活化特异性CTL疗法等，此外有研究表明用抗HBs-抗CD3双特异性抗体，或用HBV包膜蛋白/CD3/CD28嵌合抗原受体转基因表达可介导特异性杀伤，清除HBV感染肝细胞。目前已有几种治疗性疫苗进行了治疗CHB的临床试验，但大多数针对CHB的免疫制剂或疗法还处于临床前研究阶段。
5. 小结与展望
理想的抗HBV药物应具备以下条件：①具有强效的抑制病毒复制能力，耐药发生率低；②可激发宿主自身的抗病毒免疫应答能力；③具有良好的安全性；④作用持久，停药无反跳；⑤可最终清除病毒。目前临床应用的抗HBV药物尚不能完全满足上述要求，因此须要研发针对不同靶位的新型强效抗HBV药物，为实现多靶位药物联合抗HBV治疗奠定基础，为慢性HBV感染性疾病的治疗提供更多手段。
摘自：2013北京地区肝病与感染学术年会论文集