第二军医大学微生物学教研室 戚中田
核酸疫苗又称DNA疫苗或基因疫苗,是最近几年从基因治疗研究领域发展起来的一种全新疫苗,其出现被誉为第三次疫苗革命。核酸疫苗的本质是指能在哺乳动物细胞内表达重组蛋白抗原的质粒DNA,通过肌肉注射等途径接种动物或人后, 其携带的外源基因能在宿主细胞表达目的蛋白并诱导免疫应答。1992年以来,应用这一技术已成功地在小鼠、鸡、牛、黑猩猩等多种动物和人体诱生抗病毒、细菌、原虫和肿瘤免疫应答。核酸疫苗在实验动物的免疫效力及其性质稳定、成本低廉等特点使其成为今后疫苗发展的显而易见的选择。有些核酸疫苗不仅能高效诱导免疫应答,而且有潜在的治疗作用。随着对核酸疫苗免疫机制认识的不断深入和对核酸疫苗结构及免疫方法的不断改进,这种新型疫苗必将成为人类战胜感染性疾病的有效工具。
一、 核酸疫苗的作用机理
目前对核酸疫苗免疫机理的认识可概括为以下3个方面：
1、核酸疫苗在非淋巴系统的组织细胞,如肌细胞内表达抗原,再被分泌或被损伤的细胞释放到组织间隙,最终被ApC捕获、加工、提呈给T细胞,诱生免疫应答。肌注途径接种主要转染的细胞是肌细胞,但肌细胞仅低水平表达MHC I分子,不表达MHC II分子及T细胞活化所必须的一些粘附分子和共刺激分子如B7,因此,表达抗原的肌细胞不足以直接提呈抗原。推测由肌细胞提供MHC-抗原第一刺激信号,由比邻的巨噬细胞或树突状细胞(dendritic cell)等专职APC提供第二刺激信号诱导CD8+ T细胞的活化,但用SCID小鼠为模型发现,抗原必须从肌细胞转移到专职APC,经过这类细胞加工、处理后才可能刺激CD8+ T细胞的增殖、分化。尽管如此,肌细胞能作为抗原储存库,有利于免疫应答的放大和免疫记忆的形成。
2、抗原提呈细胞(APC)直接摄取核酸疫苗,表达抗原并提呈至T细胞,触发免疫应答。以任何途径接种核酸疫苗,APC都可能直接摄取质粒DNA,表达外源蛋白,以内源性抗原的加工、提呈方式诱导细胞和体液免疫应答。实验结果表明,树突状细胞是核酸免疫过程中的最重要APC,B细胞不参与核酸免疫过程中的抗原提呈。而树突状细胞是抗原提呈能力最强的APC,是能够激活静止性T细胞的唯一APC。小鼠后肢肌注接种核酸疫苗后,树突状细胞能直接摄取质粒DNA,并迅速迁移到腹股沟淋巴结。皮下接种核酸疫苗,能在小鼠脾脏检测到含有核酸疫苗的树突状细胞。体外以核酸疫苗转染的树突状细胞能分别在体外、体内有效诱导CTL应答。因此,树突状细胞直接摄取核酸疫苗表达内源性抗原是激发免疫反应的一个重要途径。皮肤组织分布有大量格郎罕氏细胞(树突状细胞)等专职APC,以基因枪皮内接种DNA疫苗诱导免疫应答的效率明显高于以其他途径接种者,原因极可能是这种方法能使大量APC被DNA疫苗直接转染。
3、细菌来源的质粒DNA能刺激APC分泌多种细胞因子从而调节T、B细胞功能,发挥强大的免疫佐剂作用。用人工合成的寡核苷酸进行DNA结构和免疫功能分析,发现位于两个嘌呤和两个嘧啶之间的非甲基化CpG序列的免疫刺激能力最强。因此,可以从功能上将核酸疫苗分为两个单位：转录单位和佐剂单位。除基因枪皮内接种外,其他途径接种DNA疫苗,绝大部分DNA在组织间隙被核酸酶降解为小的核苷酸片段,虽然这些降解片段不能被转录,但更易于进入APC,并结合、激活核转录因子,诱导TNF-a、IL-2、IL-12、1L-18等细胞因子的表达,这些细胞因子能多克隆活化B细胞,促进NK细胞活化和分泌IFN-g等细胞因子、并使静息性Th细胞增殖,向Th1亚群分化。在核酸免疫往往以强的细胞免疫应答为重要特征,这更可能与APC直接获取质粒和质粒的免疫佐剂功能有直接关系。
二、提高核酸疫苗免疫效果的措施
虽然大量报道核酸疫苗能在小鼠等动物诱导高效免疫应答,但迄今为止在人体获得满意免疫效果的报道尚少,通过不同途径进一步增强核酸疫苗在大动物体内的效力是目前该领域的研究重点之一。
1、优化核酸疫苗的转录调控结构,提高其表达水平。CMV、RSV或SV40病毒启动子在细胞培养中能高效转录,但其在体内的转录活性受TNF-a、IFN-g等细胞因子抑制,转录活性往往不高,因而哺乳动物细胞启动子如MHCI、EF-1启动子更适合用于DNA疫苗。利用RNA复制子如甲病毒属的Sindbis病毒的非结构基因(RNA依赖的RNA多聚酶基因)能使转录的抗原mRNA大量复制,因而能大大提高抗原的表达水平。在启动子与抗原基因之间引入内含子能促进mRNA剪接并延长mRNA半衰期。用哺乳动物细胞偏向性密码子合成抗原基因也能提高表达水平。
2、细胞因子、共刺激分子、T细胞趋化因子等基因以及CpG寡核苷酸序列,能通过不同途径促进靶抗原提呈和刺激T细胞增殖。如联合IL-12、B7-2基因与靶基因联合能明显增强细胞免疫应答,IL-4、IL-6基因能增强体液免疫应答,而联合GM-CSF、IL-2、CD40L对细胞和体液免疫应答均有促进作用。联合CpG寡核苷酸序列对CTL应答和Th1型抗体有极大的增强作用。
3、联合应用抗原加工分子基因能促进抗原在APC内的加工、与MHCI、II类分子形成复合物,向T细胞提呈。如TAP分子、信号序列能促进抗原向内质网转运,LAMP分子促进外源性抗原被溶酶体的降解,泛素促进内源性抗原在胞浆内的降解等,联合这些分子可增强细胞或体液免疫应答。
4、合成表位基因。单个CTL表位的minigene或多个CTL表位的融合基因,因排除了无关氨基酸的影响,更有利于表位在APC内的加工,能诱生比天然基因更强的CTL反应。如果同时联合强的Th表位,则能使免疫应答进一步增强。
控制抗原的细胞定位。同一抗原在细胞的定位可能明显影响免疫应答的模式和强度,如膜结合形式的流感病毒HA 核酸疫苗诱导中和抗体的效率比分泌形式的核酸疫苗强,膜结合形式HCV E2 核酸疫苗也强于其分泌形式,而对于HBV 表面抗原,表达分泌性HBsAg的核酸疫苗诱导抗体明显强于表达产物为非分泌性抗原者。
5、联合免疫佐剂。如脂质体、铝盐、磷酸盐,肌注接种前以心肌毒素、布比卡因、高渗盐水溶液诱导肌细胞变性等能促进APC在接种部位的募集和核酸疫苗被APC直接摄取。
6、改进免疫途径。如用质粒DNA直接转染体外大量扩增的树突状细胞后回输,或用沙门氏菌、志贺氏菌、侵袭性大肠杆菌为载体将核酸疫苗输送至肠道淋巴组织内的APC能将更多的质粒DNA导向树突状细胞。
三、 核酸疫苗在预防感染性疾病研究领域的进展
病毒性疾病
1、 流感病毒 核酸疫苗最早被用于流感病毒的研究。
抗 原 实验动物 效 果 研究者(时间)
流感病毒HA与牛疱疹病毒
基因多价疫苗
小鼠 诱生血高水平IgG2a抗体 Bran R1998.12 HA 小于两周的幼鼠 诱生高水平IgG2a、IgG1抗体 Pertmer TM1999.5 HA 幼年狒狒 大剂量诱生中和抗体 Bot A1999.12 HA 马 诱生高水平血清IgG及少量粘膜IgA抗体 Lunn DP 1999.5 HA 小鼠 (粘膜免疫) 诱生高水平唾液IgA抗体 Sha Z 1999.4 HA 小鼠 (鼻粘膜免疫) 诱生高水平血清IgG及少量粘膜IgA抗体 Kadowakis S1999.3 NA 小鼠 对同株和异株病毒攻击均有保护作用 Chen Z2000.8 NP 小鼠 无保护作用 Chen Z1999.10 HA/NA/matrix 小鼠 良好保护作用 Chen Z1999.2 HA/CTLA4 小鼠 CTLA4明显增强体液免疫应答 Deliyannis G2000.62、 丙型肝炎病毒
抗 原 实验动物 结 果 研究者(时间) HVR1 黑猩猩 诱生抗E2抗体和HRV1抗体及强细胞免疫应答,以同株病毒攻击明显降低慢性肝炎转化率 Forn X2000.9 E2/P7(细胞表面表达的E2) 恒河猴 产生E2/P7抗体,细胞表面表达E2的DNA结构诱生的免疫反应明显强于细胞胞内表达E2者 Forn X1999.4 E1/E2 小鼠 产生抗HRV1抗体 Fournillier A1999.9 C/E1/E2 小鼠 诱生抗体和强CTL反应 Shan M1999.12 C HLA-A2.1转基因小鼠 诱生CTL反应 Arichi T2000.1 NS345/GM-CSF 小鼠 GM-CSF能明显增强细胞免疫应答 Cho JH1999.3 CE1E2 小鼠 诱导强CTL应答 Nishimura Y1999.11
3、 人类免疫缺陷病毒
抗 原 实验动物 主要结果 研究者(时间) env 小鼠 (口服) 肠道上皮细胞表达ENV抗原,诱生CTL反应、血清IgG抗体和肠粘膜IgA抗体 KaneKo H2000.2 env 小鼠 诱导CTL、DTH和粘膜SIgA抗体 Aria H2000.4 Des/env 小鼠 诱生血清高水平中和抗体 Armand MA2000.4 gag 小鼠 诱导强体液及细胞免疫应答 Selby M2000.9 分泌型gag 小鼠 诱生CTL反应 Qiu JT2000.7 多株病毒嵌合env 小鼠(DNA/Vv bost /protein) 诱生抗多株HIV env抗体 gag 恒河猴(DNA/Vv bost) 诱导高水平CTL应答 Allen TM2000.5 nef HLA-A2转基因鼠 诱导CTL反应 Sandberg JK2000.6 nef 小鼠(联合接种IL-18表达质粒) 诱生高水平抗nef抗体 Billaut-Mult O2000.8 nef(与鼠IgG重链基因融合) 小鼠 诱生高水平抗nef抗体 Svanholm C1999.8 vif/vpu/nef 小鼠 诱生强CTL和Th1型细胞因子 Ayyavoo V2000.1 env 小鼠(联合接种CD40 L 表达质粒) 诱生高水平IgG抗体,IgG1和IgG2a水平相当,不能诱生IgA抗体 Ihata A1999.11 env、gag 恒河猴(以IL-2/IgG为佐剂) 诱生强的CTL反应 Barouch DH2000.4
除了病毒性疾病外,核酸疫苗在预防细菌性疾病(如结核杆菌、破伤风杆菌、肺炎球菌)以及寄生虫感染性疾病(如疟原虫、利什曼原虫)方面的研究
四、进行人体实验的核酸疫苗
抗 原 主 要 结 果 乙肝病毒表面抗原 诱导体液和细胞免疫应答 单纯疱疹病毒糖蛋白 进行中 HIV预防和治疗,包膜糖蛋白、核心蛋白、调控蛋白、逆转录酶 诱导抗体和细胞免疫应答 流感病毒血凝素 进行中 乳腺癌和大肠腺癌的治疗,CEA抗原 诱导细胞免疫应答 B细胞淋巴瘤的治疗,免疫球蛋白 诱导体液免疫应答 T细胞淋巴瘤的治疗,T细胞受体 进行中 前列腺癌的治疗,前列腺特异性膜蛋白 进行中
五、HBV核酸疫苗研究的一些进展
人体实验结果：美国马里兰大学医学院疫苗发展中心1999年报道,用基因枪轰击皮肤方法接种编码HBsAg 的DNA疫苗,剂量0.25mg/次,共两次,六个志愿者中一人在接种一次以后血液中即出现高滴度抗-HBs抗体,在其余五人未检测到-HBs,抗体阳转的志愿者以前曾有HBV接触史。这个结果表明HBsAg 的DNA疫苗能在人体诱生回忆性免疫反应,但低剂量不能诱生初级(primary)免疫应答。2000年,美国PowerJect 疫苗公司报道,用基因枪轰击皮肤方法接种编码HBsAg 的DNA疫苗, 剂量1、2或4mg/次,共3次,每剂量组4名志愿者,结果每名志愿者均产生了保护水平的抗体(至少10 mIU/ml)和CD4+、CD8+ T细胞免疫应答,且T细胞免疫应答主要表现为Th1型,尤其在HLA-A2阳性志愿者能诱生强的表位(HBsAg 335-343)特异性CTL反应。这两个报道均认为DNA疫苗具有可靠的安全性,被接种者能较好耐受。这些结果表明DNA疫苗用于人体以治疗乙肝可能为期不远。
本实验室在国家自然科学基金、上海市科技发展基金的资助下,根据HBV感染者免疫耐受、Th1 /Th2免疫失衡、T细胞免疫缺陷的免疫特点和核酸疫苗在人体应用的要求,设计、构建了编码融合HBV多个表位的DNA疫苗,在小鼠诱导出强的Th1型免疫应答,我们还用减毒伤寒沙门菌为DNA疫苗载体,口服途径接种小鼠,也有效诱导出了体液和细胞免疫应答。我们的结果为研制接种便利、制备简单的治疗性乙肝核酸疫苗提供了基础。
六、结语
核酸疫苗一经问世即成为免疫学领域的研究热点并在短短的几年时间内获得迅速发展,相信随着核酸疫苗免疫机理及免疫学相关理论研究的不断深入,会有更多更有效的增强核酸疫苗免疫效力的方法被发现,使这种最简单便利的基因疗法能早日服务于人类。