上海市静安区中心医院 姚光弼
2001年11月9日-13日第52届美国肝病学会(AASLD)年会在美国德州达拉斯市举行。这个会议实际上是国际性学术会议,全球的学者云集,进行交流探讨。通过参加这次会议,预感到人类在进入新世纪之际,慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎的治疗即将出现新的突破。本文简介本次会议有关慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎治疗的新资料。详细内容请参考Hepatology 2001,34：(No 4. Part 2),A32-A745;或大会发行的光盘或WWW.AASLD.ORG网站检索。
一、 慢性乙型肝炎的治疗
核苷类药拉米夫定的成功问世,推动了其他核苷类药物的研发,目前至少已有7种抗HBV药问世(见表1),估计将于今后2~5年内陆续被批准,投入市场。这将会彻底改变慢性乙型肝炎治疗的思维和策略,明显改善病人的远期转归和结局,这对广大的病人是一个福音。应用HBV病毒转染细胞模型(如：HepG 2.2.15细胞株,H61细胞株等),以筛选各种核苷类药物抗HBV的体外抗病毒效价,通常用EC50(μM)表示,凡EC50(抑制病毒50%)值的浓度(μM)越低,其抑制病毒效果越高。另外用CC50(μM)表示该药的细胞毒性,凡CC50值越高,其细胞毒性越低,如CC50值越低,则细胞毒性越高。
表1 新的抗HBV 核苷类药物
名 称 进行的 推荐治疗 开发厂商 临床试验 (剂量/d) 阿德福韦(Adefovirdipivoxil) III期 10mg(30mg) Gilead 恩替卡韦(Entecavir) III期 1mg(0.5mg) BMS(百时美施贵宝) 依曲西他平(Emtricitabine,FTC) II/III期 100mg或(200mg) Triangle L-脱氧胸腺嘧啶(LdT) II期 100mg或(200mg) Novirio Ly582563(MCC-478) I/II期 待定 Eli Llilly(礼来) β-氟脱氧胞嘧啶 I/II期 待定 Achillion 克力夫定(Clevudine) I/II期 待定 日本第一制药
通过一系列的筛选,发现了核苷类药物结构与抗病毒活力(SAR)之间的关系(见表2)。β-L-2'脱氧核苷是基本的结构,其β-L-2'脱氧戊糖的3'-OH基是抑制DNA肝炎病毒(Hepadnvirus)的关键基团。其中未取代的核苷如β-L-2'脱氧胞嘧啶(LdC),β-L-2'脱氧胸腺嘧啶(LdT)和β-L-2'脱氧腺嘌呤(LdA)抑制HBV复制具有特异性,其作用强,对人类的线粒体无毒性。如在LdC的嘧啶环的第5位碳基被卤素取代,抗HBV活力降低,但对HBV仍有特异性。如其脱氧核糖缺3'-OH基,仍抑制HBV,但特异性降低,因而对HIV也能抑制,如3TC,FTC。同样,其3'-OH被卤素取代,抗HBV的特异性消失,但仍保留对HBV和HIV的抑制活性。如同时取代第5位和缺少3'-OH,将进一步降低对HBV和HIV的抑制活性。以上研究表明,β-L-2'脱氧戊糖的3'-OH基在抗HBV起着关键的作用。在药代学研究的动物模型方面,最经典的是黑猩猩的慢性HBV感染,与人类的HBV感染十分相似。但动物来源有限,价格昂贵,限制了广泛应用。鸭乙型肝炎模型(DHBV)与人类HBV感染相差较大,只能作为初步筛选,不能作为抗病毒较确切的药效学研究。美洲旱獭(又称土拨鼠,Woodchuck)的慢性乙型肝炎病毒模型(WHBV)目前应用最多,与人类乙型肝炎病毒感染也接近,而且此动物模型可以显示出对线粒体的毒性。历史的经验表明,在20世纪90年代前,一种抗HBV药FIAU(氟碘阿糖尿嘧啶)在临床前的毒理学研究中均未在几种哺乳类动物中观察到对肝细胞线粒体的毒性,但在II期临床试验时发现对线粒体的毒性,导致死亡,因而中止试验。用美洲旱獭模型可以发现该药对线粒体的毒性,因其线粒体对药物的反应与人类近似,所以目前在临床前毒性和药效学研究中采用美洲旱獭的模型。
表2 L-dC,L-dT和L-dA类似物的SAR
化合物 R1 R2 R3 X EC50(μM)* 结 构 Anti-HBV in Anti-HIV in 2.2.15 cclls PBM cclls L-dC H H OH CH 0.24±0.08 >200 L-5FdC F H OH CH 5 >100 L-5-ClddC Cl H OH CH 10 >100 L-ddC H H H CH 0.1 0.26 3TC(拉米夫定) H H _b S 0.05±0.01 0.002 L-3'-azido-5-FddC F H N3 CH 0.11±0.09 0.05 L-3'-FddC H H F CH 0.5 82 FTC F H - S 0.04 0.008 L-5-CldC Cl H H CH 10 >100 L-d4C H - - CH <0.1 1.0 L-d4FC F - - CH <0.1 0.034 L-3'-F-5-FddC F - F CH 4 >100 L-5-FddC F - - CH 0.10±0.05 0.021 L-dT H OH 0.19±0.09 >200 L-ddT H H >10 >100 L-3'-FddT H F >10 >100 L-3'-azido-ddT H N3 >10 >100 L-3'-amino-ddT H NH2 >10 >10 L-d4T - - >10 >100 L-xylo-dT OH H >10 >10 L-dA H H OH 0.09-1.9 >10 L-2-CldA Cl H OH >10 >10 L-ddA H H H 5 >10 L-ddA H - - 0.08±0.10 0.38 L-3'-azido-ddA H H N3 5 >10 L-3'-amino-ddA H H NH2 >10 >10 L-3'-fluoro-ddA H H F >10 >100 L-ddAMP-bis(terbutyl-SATE) H H H 0.08±0.03 0.002 L-3'-azido-d4A H - N3 >10 >100*EC50=有效抑制病毒50%的浓度用μM表示。
引自：Bryant ML, Bridges EG, Placidi L, ET AL. Antimicrob Agent Chemother,2001,45:229-235.
理想的抗乙型肝炎病毒药,至少应具有下列特点：(1)具有很强抑制HBV复制的效力。一般来说,服药后,病人血清内病毒载量要下降2log10~3log10以上。(2)安全性好,长期服用毒性低,药物相关严重不良反应发生率很低,无致癌或致畸胎作用。(3)作用持久,停药后发生反跳少。(4)耐药性低,HBV发生耐药性变异株的机率低。(5)同时具有激活宿主抗病毒的免疫应答。(6)最终清除体内的病毒,特别是能清除肝细胞和单个核细胞内HBV的ccc DNA。目前开发的几种核苷类新药与理想的药物尚有相当差距,但如能合理联合应用,包括与其他免疫调节剂的配合,仍可能取得较好的疗效。已进行了III期临床试验的3种药(见表1),其中阿德福韦对已产生拉米夫定耐药性(YMDD变异)的慢性乙型肝炎有效。经1年的临床试验尚未发现有变异株和耐药性,但该药有肾毒性,动物实验表明对肾上皮细胞的线粒体有毒性。30mg/d剂量有25%病人出现血清肌酐上升,需减至10mg/d,且可能影响抗病毒效果。阿德福韦今后的发展方向,可能与拉米夫定联合应用,似乎不能成为单独用药的主流。恩替卡韦对耐药病人(YMDD变异)也有效果,且每日剂量很小(0.5~1.0mg/d),但长期应用的安全性尚需进一步评估。FTC与拉米夫定有交叉耐药性,似乎发展前景不大。LdT、Ly582563等几种新秀,似乎抗病毒效力更大,但需通过临床试验来确定,泛昔洛韦无研究前景;阿糖腺苷(单磷酸钠)、阿昔洛韦、磷甲酸钠早已被淘汰,在国外均未被通过注册,也未正式上市。
二、 慢性丙型肝炎的治疗
自从上世纪90年代应用干扰素(IFN)治疗慢性丙型肝炎取得一定成功以来,经过不断的总结,其远期疗效从10%~15%提高至50%~60%左右。期间经历了下列发展阶段：(1)IFN 3MU 1周3次,疗程6个月。(2)IFN 3MU,1周3次,疗程12个月。(3)IFN 3MU,1周3次,加用利巴韦林1000~1200mg,每日1次,疗程12个月。(4)聚乙二醇化干扰素(PEG-IFN),每周1次,疗程12个月。(5)PEG-IFN每周1次加用利巴韦林1000~1200mg每日1次,疗程12个月。(6)当前进一步的研究是对PEG-IFN或IFN(或加利巴韦林)治疗无效或复发病人如何提高疗效,以及慢性丙型肝炎肝硬化病人肝移植后如何防止丙型肝炎复发。PEG-IFN的开发为90年代后期的一个重要发展,干扰素与聚乙二醇联结后,从肾排泄明显减少,清除半衰期明显延长。提高和延长体内和血液内IFN的浓度,可更大地发挥其抗病毒和免疫调节活性。对治疗慢性丙型肝炎和慢性乙肝炎均较单用IFN为优。应用PEG治疗慢性丙型肝炎疗效基本上与利巴韦林联合应用的效果相同,对单用IFN无效或复发病人有较显著的效果。PEG-IFN有 2种产品：一种为Roche公司的PEG-IFNα2a(又称Pegasys),相对分子质量为40 x 103;另一种为Schering-Plough公司的PEG-IFNα2b,称PEG Intron-A,相对分子质量为12 x 103,在本次会议中以PEG-IFNα2a的研究报告较多。目前的方向是PEG-IFN与利巴韦林联合应用,特别适用于基因型I型病人,以及治疗无效或复发的病人。PEG-IFNα2a治疗慢性丙型肝炎的疗效已经肯定,其不良反应与普通IFNα2a相似(请参考：Zeuzem S, et al. N Engl J Med, 2000,343:1666-1672; Reddy KJ et al. Hepatplogy, 2001, 33: 433-438)。慢性丙型肝炎合并肝硬化病人对普通IFN的治疗应答差,PEG-IFN的疗效如何？根据一项北美、欧洲和澳大利亚多中心的研究,慢性丙型肝炎肝硬化或有桥状纤维化病人271例按1：1：1分成IFNα2a 3MU,PEG-IFNα2a 90μg和180μg 3组,治疗48周,停药随访72周。72周时这3组的持续病毒应答率分别为8%、15%和30%(P=0.004);组织学应答率为31%、44%和54%。180μg组疗效与IFN加利巴韦林相当。这3组病人的不良反应基本相仿,中途退出率分别为8%、7%和13%。
应用PEG-IFNα2a 180μg每周加利巴韦林800~1200mg每天治疗慢性丙型肝炎,对1300例病人的中期分析表明,近期疗效(治疗结束时应答率)达84%(基因I型为75%,2型为97%)。对PEG-IFNα2a 失效的病人,分别加用利巴韦林、金刚胺或利巴韦林加金刚胺,停药24周后的持续病毒应答率,在复发组病人分别为32%、31%和31%;在无效组分别为30%、29%和31%。另外有报道,应用PEG-IFNα2a 取得疗效后长期随访,凡于停药后24周取得疗效者,2~3年后99%仍持续有效。PEG-IFNα2a 治疗较IFNα2b加利巴韦林更能显著改善病人的生存质量(QOL),包括体格健康、乏力感、活动能力、情绪、社会功能和疾病痛苦等方面。分析4个多中心随机试验共3010例初治病人,用PEG-IFNα2b(Intron A)加用利巴韦林治疗48周,组织学改善率为73%,单用PEG Intron A为39%。在联合用药组中治疗前159例有肝硬化,治疗后组织学改善或逆转率为49%(75例)。应用PEG-IFNα2a 联合利巴韦林预防或治疗HCV肝硬化肝移植后的丙型肝炎复发,能显著降低血清内HCV的载量,但其远期效果尚待考核。
PEG-IFN和利巴韦林虽取得明显效果,但对基因I型的HCV感染仍不够理想,其次不良反应发生率高,少数病人不能完成疗程。最近报告2种利巴韦林的同系药：Levovirin(左旋韦林)和Viramidine可减少利巴韦林的溶血性贫血不良反应。左旋韦林是利巴韦林的L-糖基异构体,与利巴韦林有相似的抗病毒和免疫调节作用,但在动物实验中没有利巴韦林相关的毒性。I期临床的耐受性试验,健康志愿者分别服用200、400、600、1200mg/d,共1周,未见不良反应,耐药性好。Viramidine系以肝脏为靶器官的利巴韦林前体药,在肝内经腺苷脱氨酶转化为利巴韦林,但对红细胞作用小。该药与后者有同样的免疫调节作用,激活I型的细胞因子介导的免疫应答,诱导IL-2、IFNα和TFNα的产生。该药在动物实验中也无溶血的不良反应。这2种制剂可能会替代利巴韦林。在研究中治疗丙型肝炎的新药有皮下注射组胺盐酸盐加IFNα、核酶、反义HCV RNA(由20个磷酸脂的寡脱氧核苷组成)和HCV蛋白酶抑制剂等,但尚不成熟。
三、 病毒动力学在药物研究中的应用
评价抗病毒药通常采用治疗前后对循环血液内病毒载量的效应。一般认为有效的抗病毒药至少应使循环内的病毒载量(DNA或RNA)下降2~3log10或以上。根据给药后血液内病毒载量消长与时间的关系,应用数学模型的方式,计算出抗病毒药对病毒动力学的影响,可以更好、更精确地了解和比较不同药物的抗病毒疗效。目前这种方法已用于HBV、HCV和HIV药物研究。在一定时期内,被感染者体内病毒的生成与消失为动态平衡(见图1)。图示靶细胞(T),感染细胞(I)与游离病毒(V)之间动力学的关系。病毒以一定的速率产生(P),释放到循环内,并被宿主清除(C)。靶细胞的感染常数为β,健康的肝细胞成为被感染细胞(I)。抗病毒药可减少病量载量,防止其感染新的靶细胞(I-n),其抑制病毒的效率用1-ε表示。通过数学模型公式,可计算出病毒产生的速率、病毒的半衰期(T1/2)和清除率(C)。在抗病毒药作用下,病毒产生被抑制,清除加快,可计算出抗病毒效力(ε)和感染细胞的死亡率(s)。如在给药后定期检测血液内病毒载量,绘成曲线,可以将抗病毒药的作用曲线分成诱导相和维持相,前者又可进一步分成第1相和第2相。应用这个曲线模式,在第1相时,就可以预测到药物对每个病人的疗效应答(见图2)。一般来说在4周内可以预测是否有效,如果无效,则应调整治疗方案或剂量。
结语：预计在未来10年内慢性病毒性肝炎的治疗将有重大突破。环顾国内的新药开发大多为低水平重复,甚至将国外淘汰的药开发推广,应引起关注。值此我国加入WTO之际,我国的医药界应急起直追,赶上形势。