肝炎研究新途径——基因克隆化
2006.05.08 4版 医生论坛:前沿 编辑：郑颖璠 作者:方彤 陈明莲
尽管关于病毒性肝炎的发病机理目前还有许多方面是未知的，但一些研究已经明确告诉我们，病毒在进入肝细胞后会影响肝细胞内基因表达。要想从基因层面寻找并得到那些与肝炎病毒相关的基因，基因克隆化是一种有效的途径。在日前北京地坛医院举办的全国首届感染病学术会议上，该院成军教授和同行交流了通过基因克隆化对肝炎进行的一些研究。
病毒嗜肝特性从何而来
在人体的很多细胞中都能检测到肝炎病毒，惟独肝细胞此时显得很脆弱，为什么会产生这种嗜肝特性呢？
大量研究资料表明肝细胞中的大分子环境，更加适合肝炎病毒的复制和表达，这些因素不是别的，就是肝细胞中特殊的蛋白质成分。换句话说，病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节。
要找到这些能影响病毒基因的蛋白质因子，可以有很多基因克隆化方法，其中酵母单杂交技术一方面可以克隆基因，而后还能用于研究被克隆基因的功能，因此具有重要应用前景。成教授等曾利用酵母单杂交技术筛选SP1（一种乙肝病毒基因启动子）的结合蛋白，发现了一种由92个氨基酸残基（aa）组成的新蛋白，命名为SP1启动子的结合蛋白1（SBP1），后证实SBP1对于SPI启动子的转录活性具有显著的抑制作用，是SPI启动子的一种负调节因子。从而为研究SPI启动子的转录调控，开辟了新的研究方向。
病毒怎么影响肝细胞
肝炎病毒蛋白在肝细胞中不是孤立存在的，肝炎病毒感染肝细胞之后，改变了细胞正常的分裂、增殖、凋亡的信号传导途径，这就是肝炎病毒引起各种类型慢性肝脏疾病的重要机制所在。如果肝炎病毒蛋白结合的蛋白属于一种蛋白酶，那么就可能改变这种蛋白酶的活性；如果肝炎病毒蛋白结合的蛋白属于一种底物，那么就会改变作为底物的性质。所以，从研究肝炎病毒蛋白结合蛋白的方面入手，是阐明其致病机理的重要突破口。
在研究肝炎病毒蛋白结合蛋白的多种技术中，酵母双杂交技术经过这几年的改进，效率显著提高，假阳性率进一步降低，成为后基因组计划中重要的技术平台。
成教授等应用酵母双杂交技术对于HBV、HCV肝炎病毒蛋白结合蛋白进行筛选，发现肝炎病毒蛋白结合蛋白的种类非常多。其中既有已知功能蛋白基因，也有未知功能蛋白基因。例如，经过研究发现HCV核心蛋白与载脂蛋白AI（APO－AI）和载脂蛋白AII（APO－AII）结合。根据这一结果，结合临床上见到慢性丙型肝炎患者肝脏活检组织的基本病理表现是肝脂肪变，因此考虑慢性丙型肝炎肝脏脂肪变的基本分子生物学机制很可能就是HCV核心蛋白与APO－AI、APO－AII之间的结合，干扰了肝细胞中正常的脂类代谢。
另外，经过研究还发现了一种新蛋白可以与HBV的前－S1蛋白结合，称为HBV前－S1蛋白结合蛋白（PreS1BP）。需要指出的是，这里的基因克隆化已不再是简单地对基因进行结构和序列的克隆，而发展到从功能角度入手，找到与已知基因有相互作用的基因序列，然后再进行针对性的研究，即功能性克隆策略。通过这种功能性克隆策略，提示这种编码基因实际存在的可能性，而且至少提示这种蛋白与HBV的前－S1蛋白能够结合。HBV、HCV结合蛋白筛选的成功，拓宽了噬菌体表面展示技术的应用范围，为研究蛋白－蛋白相互作用提供了一个高效的研究途径。
如何找到反式激活靶基因
反式激活是指特殊蛋白质进入细胞后，可通过信号传导促进或改变其他基因的表达。肝炎病毒蛋白对于肝细胞基因组表达的反式激活作用早已被人们广泛认识，是与肝炎发生发展密切相关的重要分子生物学机制。
分子生物学技术的发展，为研究和克隆肝炎病毒蛋白反式激活基因提供了前所未有的机遇。抑制性消减杂交技术是目前较为成熟的克隆与发现反式激活新基因的不可替代的技术途径，它不仅可以筛选得到功能已知的基因，还能筛选到功能未知的基因。因此，抑制性消减杂交技术在相当一段时间内具有广泛的应用前景。