构建乙型肝炎核酸疫苗的几条新思路

　　刘 宏,赵连三

　　刘宏, 四川大学华西医院传染科 四川省成都市 610041

　　赵连三, 四川省感染性疾病分子生物学重点实验室 四川省成都市 610041

　　项目负责人 刘宏,610041,四川省成都市,四川省感染性疾病分子生物学重点实验室. zhaoliansan@btamail.net.cn

　　收稿日期 2002-01-09 接受日期 2002-01-28

　　摘要

　　近年来兴起的核酸疫苗的研究在乙型肝炎的防治中显示出诱人的前景，引起了国内外学者们的关注.然而，研制高效低毒的乙型肝炎核酸疫苗仍是目前研发的主要目标.本文就如何构建高效的乙型肝炎核酸疫苗提供了几条新思路.

　　刘宏, 赵连三. 构建乙型肝炎核酸疫苗的几条新思路. 世界华人消化杂志 2002;10(3):349-351

　　

　　0 引言

　　乙型肝炎核酸疫苗就是将乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)一种或几种抗原的编码基因直接注入宿主体内，该基因能在宿主细胞内转录和表达，并继而诱生特异的体液和细胞免疫应答.这类疫苗不含蛋白质或多肽，仅含核酸，在体内表达后具有疫苗功能，被称作乙型肝炎核酸疫苗,包括DNA疫苗和RNA疫苗,主要是指DNA疫苗.近年来兴起的核酸疫苗的研究已在乙肝的防治中显示出诱人的应用前景，引起了国内外学者们的

　　关注.

　　 与传统的血源疫苗和基因工程相比，乙肝DNA疫苗有很多优点,如:比乙肝血源疫苗相对安全;比基因工程多肽疫苗的制备简单、快捷; 性质更稳定,便于保存和运输; 乙肝DNA疫苗还可通过对目的基因的构建,选择所需的抗原决定簇,可以对同种异株的病毒产生免疫应答，发挥交叉保护作用.更为重要的是,乙肝DNA疫苗可在机体的真核细胞中表达糖基化抗原蛋白,并可按照病毒抗原的天然构象进行折叠,模拟了病毒的自然感染过程,不仅可以诱导针对HBsAg的保护性抗-HBs产生,而且可以同时诱发特异的细胞免疫,所以兼有预防和治疗作用［1-8］.然而,乙肝DNA疫苗虽然可在啮齿类动物中诱发有效的免疫应答,但在灵长目类动物中则效率很低,且存在安全性方面的问题［9］.例如:尽管概率很低，DNA疫苗有整合进入宿主细胞,引起癌变的可能性［10，11］; DNA疫苗在体内持续表达外源抗原还可能引起免疫耐受; 已经证实: DNA疫苗可诱生抗DNA抗体,虽然目前的研究表明这些抗体不能导致和加速自身免疫性疾病［5］,但是尚不能完全排除其致病可能性.

　　 如何增强乙肝DNA疫苗的免疫效力,减少其用量,排除其安全隐患,成为目前的研究重点.尽管DNA疫苗导致免疫反应的机制尚未明了,抗原肽的靶向性、MHC分子的识别和递呈抗原的作用、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells, CTL)在病毒清除中的重要作用和细胞因子对免疫应答的调控都是非常重要的方面.在基因水平上构建乙肝DNA疫苗,着眼于上述关键环节,可大大地提高乙肝DNA疫苗的效力.

　　1 考虑抗原肽的靶向性

　　肌注或皮内注射DNA疫苗分别主要被肌细胞和角化细胞摄取.但是,这些表达编码蛋白的转染细胞基本上不能启动免疫反应.越来越多的证据提示:树突状细胞(dendritic cells, DCs)作为作用最强大的抗原递呈细胞(antigen-presenting cells, APCs)在DNA疫苗诱导的免疫应答中有非常重要的地位［13，14］.因此,加强DCs的抗原递呈是提高DNA疫苗效力的很有前景的方法.

　　 DCs表达IgG Fc段受体(FcγRs),他介导抗原-IgG复合物的内吞和促进MHCⅡ类分子［l2］限制性的抗原高效率地递呈,比液态胞饮作用的效率强1000-10000倍［15-16］.FcγR介导的胞吞作用还能交叉提呈内化的抗原给MHCⅠ类分子［17-21］.并且,Fc与FcγRs的相互作用可上调与抗原递呈有关的表面分子和细胞因子而激活DCs［16］.因此, FcγRs代表了一条由DCs递呈的MHC分子限制的有极大优势的抗原内化途径［14-16］.

　　 You et al［22，23］构建了一种表达HBeAg和Ig Fc段融合蛋白的DNA疫苗,用来免疫C57BL/6小鼠.小鼠体内可合成和分泌抗原-Fc融合蛋白.这种融合蛋白除了可以诱导B细胞,还可以通过受体介导的胞吞作用被DCs高效地捕捉和摄取,并呈递给MHCⅡ类和Ⅰ类分子(交叉启动).实验结果显示：这种疫苗可以广泛地加强抗原特异性的CD4+T辅助细胞、CD8+细胞毒性T细胞和B细胞反应.这种疫苗策略为治疗性和预防性的DNA疫苗的设计提供了一个新思路.

　　2 构建多表位DNA微型基因结构启动多特异性CTL应答

　　目前有很多研究认为: CTL在根除细胞内病原体慢性感染和肿瘤方面有重要作用.CTL可通过彼此独立的两条途径：穿孔蛋白途径和FAS/FASL介导的细胞凋亡途径对细胞产生细胞毒作用.更为重要的是CTL启动的炎性因子（特别是INF-γ及TNF-α）在清除病毒过程中占主导地位.这些细胞因子作用于肝巨噬细胞，使产生更多的TNF-α，并活化肝细胞进入抗病毒状态，在保全感染细胞的条件下清除病毒.这种非细胞破坏型的病毒清除效应比CTL诱导细胞凋亡的效应高10-100倍［24-26］.

　　 然而,重组蛋白疫苗不能可靠地诱导CTL应答,在人群中使用减毒活疫苗因存在安全性问题有很大的局限性.另一方面,在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）、HBV、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）和疟原虫（malaria）等病原体引起的疾病中,不但要诱导强大的CTL应答,还要诱导出针对高度保守的抗原决定簇的CTL应答,以防止突变株的免疫逃逸.并且,直接诱导出同时针对多表位的广泛的CTL应答也显得十分重要［2］.以HIV感染为例,感染者可能从多特异性CTL应答中受益.快速进展的HIV感染者的CTL应答的范围很窄,而病情几乎无进展的患者的CTL应答是广泛的多特异性的［27，28］.另外,由于CTL、Th、B细胞反应还受到MHC分子的限制,若要诱导更广泛的细胞和体液免疫反应,除了要求抗原肽含有多种CTL表位外,还要求体内转化后的小分子抗原肽能广泛地与MHCⅠ类和Ⅱ类分子结合.

　　 Ishioka GY et al［29］构建了一种“串珠样”多表位DNA微型基因结构,该基因编码来自HIV和HBV囊膜、核壳、和聚合酶蛋白的9个HLA-A2.1-和A11-限制性显性表位,辅以泛DR表位(pan-DR epitope, PADRE)和内质网易位信号序列,可以诱导针对多个保守抗原决定簇的多特异性的CTL应答,可在HLA转基因小鼠体内同时诱导出针对9个表位的特异性CTL反应,其强度与一种免疫原性很强的脂肽疫苗所诱生的CTL反应相似.单剂注射后,他诱发的记忆性CTL可持续4mo.与编码全蛋白的DNA疫苗相比,他可诱导更广泛的表位特异性的CTL应答.由外源DNA编码的体内肽段的免疫原性和对转染细胞特异的CTL细胞系的体外反应之间有相关性.考察微基因结构设计中的不同方案提示:去掉PADRE Th细胞表位和信号肽序列或改变所选择的表位肽的位置可以影响CTL反应的广度和频率.实验结果提示:在体内应用针对多种HLA-限制性显性表位的微型基因结构DNA疫苗可诱导出广泛的CTL反应.

　　 为了突破HLA分子的限制性还可采用HLA超型理论构建疫苗.T细胞表位肽中有一些特定的与HLA分子结合的部位,被称为锚点(anchor position).在锚点上的氨基酸被称为锚点残基(anchor residue).抗原肽与MHC分子的结合既具有特异性又具有混杂性.特定的锚点残基与特定的MHC分子结合显示出高度的特异性.然而与不同等位MHC分子相结合的肽是不同的,但是这些不同的抗原肽的锚点残基往往相同或相似,这些相同或相似的氨基酸序列被称为共用基序(consensus motif).凡符合共用基序的抗原肽均可与同一类HLA结合,这些有共同基序的HLA被称为HLA超型(HLA supertypes),重叠的基序被称为超基序(supermotifs).在DNA疫苗的构建中通过选择和改造外源基因可以使其在体内转化的小分子抗原肽含有HLA超基序,这样就可突破HLA分子的限制性［30-32］.

　　 辅助性T淋巴细胞应答在诱导体液和细胞免疫中也起着重要作用.有些学者认为虽然HBV病毒特异性T细胞活性损伤是慢性感染的主要原因，但是针对HBV的强大的多特异性的T细胞反应仅与长期控制有关，而与病毒清除无关.研究发现，在同种异体的促血细胞生成素细胞移植中的HBsAg的血清学清除的过程中，HBsAg的血清学转换与供者的HBcAg特异性CD4+T淋巴细胞的活性有关.这提示供者的HBcAg特异性CD4+T淋巴细胞为HBsAg的血清学转换提供了“分子间的T细胞帮助”［33,34］.因此，辅助性T细胞表位应是治疗性疫苗的重要组成部分.PADRE是基因工程制备的泛DR辅助性T细胞表位，他以高亲和力与常见的HLA-DR分子结合，发挥强免疫原作用；含PADRE-B细胞表位的线性肽能诱导抗原应答，以IgG抗体为主.而且PADRE表位能增强疫苗激发细胞免疫的能力，在HBV转基因小鼠模型中，含PADRECTL表位的Theradigm脂肽可打破CTL耐受［35］.编码PADRE的基因序列在体内合成的PADRE可增强机体的细胞和体液免疫应答,这在Ishioka GY的实验中也得到了证明.

　　3 采用具有佐剂作用的核酸片段

　　近年来发现一些核酸片断具有明显增强机体对核酸疫苗的免疫应答的作用，他们无传统佐剂的副作用，比蛋白质分子佐剂的半衰期长，能到特定部位发挥作用，成本低廉，是有很好的应用前景的新型佐剂，此类核酸片断具有代表性的有：

　　3.1 非甲基化胞苷酸鸟苷（Cytosine Phosphate Guanidine，CpG） 不同于脊椎动物的DNA，细菌DNA含有高得多的CpG二核苷酸,被称为“CpG基元”（CpG motif）.他能激发脊椎动物产生偏向Th1型的保护性免疫应答［36-38］，这种应答可用合成的寡脱氧核糖核苷酸（oligodeoxynucleotides，ODNs）来模拟［39,40］.CpG DNA/ODNs可直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞分泌Th1型细胞因子和上调细胞表面协同刺激分子的表达［41］.再没有特异性抗原的情况下，CpG DNA/ODNs可以明显激活记忆性CD8+T细胞和部分激活幼稚型T细胞［42,43］.CpG DNA/ODNs还能增强自然杀伤细胞的杀伤活性，促进其分泌IFN-γ［44］.科研中已将CpG DNA/ODNs作为免疫佐剂分别用于蛋白疫苗、T细胞疫苗和DNA疫苗，取得了很好的免疫效果［45-47］.比较其他免疫佐剂，CpG DNA/ODNs还有犊性低的优点［48］.

　　3.2 编码细胞因子的核酸片段 抗原在通过MHC-II类分子递呈过程中，能产生免疫调节作用.CD4+T细胞有两类：CD4+Th1细胞和CD4+Th2细胞.前者主要分泌IFN-γ，TNF，IL-2增强细胞免疫应答，而后者主要分泌IL-4，IL-5，IL-6及IL-10增强体液免疫应答.在DNA疫苗中插入细胞因子的基因序列可使细胞因子在特定部位合成并发挥其免疫调节作用.

　　3.2.1 目前已用于HBV核酸疫苗的编码细胞因子的核酸片段表1总结了近年来这方面的主要实验，从中可得出结论，IL-2、IFN-1主要增强CD4+T细胞向Th1亚群分化，增强细胞免疫应答；IL-4主要增强体液免疫应答；IL-2、GM-CSF则可使两者均有增加［49］.另有实验表明：将编码IL-2的基因插入HBV核酸疫苗的质粒中，表达的是HBV抗原蛋白与IL-2的融合蛋白，他的免疫原性大大高于分别表达上述两种蛋白的质粒DNA，若要两种疫苗制剂达到相同的免疫效果，后者的剂量需增加100倍［50］.将编码细胞因子的表达载体与HBV基因疫苗共免疫，也可调节免疫应答［51］.

　　表1 几种代表性基因佐剂的免疫作用

插入的基因Th1/Th2抗-HBs抗体CTL反应 HBsAg表达同源的肿编码IL-12/IFN-1 Th1↑/Th2↓IgG1↓,IgG2a↑最强缩小明显编码IL-4Th1↓/Th2↑IgG1↑,IgG2a↓受抑不缩小编码IL-2/GM-CSFTh1↑/Th2↑IgG1↑,IgG2a↑次强－－

　　3.2.2 编码其他细胞因子的核酸片段 各种编码其他细胞因子的核酸片段也作为佐剂广泛用于其他病毒性疾病的DNA疫苗中,若将他们用于乙肝核酸疫苗中，很可能也有佐剂作用［l3］.(1)IL-1β的163-171位氨基酸残基组成的九肽VQGEESNDK在活体中有免疫刺激和佐剂效果，但没有表现任何IL-1β的炎症、血管活性、致瘤和全身毒性效应，他也不能合成TNF-α或其他分子导致中毒和休克.含有IL-1β此结构域的DNA序列的DNA疫苗在实验中得到阳性结果.因此在多效性的细胞因子的基因中可区分选择出具有免疫刺激功能的序列，用于设计构建新型疫苗［52］.(2)用IL-6的基因序列与表达NP和HA抗原的DNA序列构建的流感病毒A核酸疫苗免疫小鼠，发现IL-6基因序列可使小鼠在接种后早期（4-7W）抗体反应性地加强，并可使NP特异性CTL反应加强［53］.(3)用IL-15的基因序列作为基因佐剂，加入表达包膜蛋白的HIV-1 DNA疫苗中，鼻内接种小鼠，可发现IL-15基因的作用可使HIV-1特异性DTH反应增强，IgG1/IgG2a比值下降，机体产生偏向Th1型的免疫应答［54］.(4)用IL-12和IL-18的基因与HIV DNA疫苗共同接种猕猴，可观察到加强的抗原特异性的Th增生反应.用INF-γ和IL-18的基因与HIV DNA疫苗共同接种猕猴，可加强抗原特异性的抗体反应，这个实验将含有表达细胞因子的核酸片段的DNA疫苗应用到了灵长目动物模型，显示了此类佐剂在疫苗领域中的应用前景［55］.(5)含有M-CSF基因的DNA疫苗可增加CTL反应至较高水平,这种CTL反应是CD8+T细胞依赖性与注射局部的CD11C+细胞相关，并且与β趋化因子-MIP-1β的抗原特异性诱导有关［56］.

　　3.3 共刺激分子类核酸片段 表达共刺激分子及其配体的基因序列也可作为DNA疫苗的佐剂［57］.

　　

　　4 结语

　　未来核酸疫苗的目标应是可用于预防和/或治疗的既安全又有效的疫苗.基因组的设计是核酸疫苗构建中的重要部分.表达库免疫（expression library immunization, ELI）的目的是为了明确病原体的哪个或哪些基因应当插入基因免疫的载体中.其方法是先消化切割基因组DNA,使之成为保护性基因,再将酶切片段分别与真核表达载体连接.用全部或部分基因库给很多动物免疫接种,从而了解基因组或解体病原体的多个表达蛋白哪一部分可以产生有效的免疫保护作用,据此筛选最佳的目的基因.同理，具有佐剂作用的核酸片段和载体也可以用理论推理和实验方法加以筛选.希望能够研制出可以用于人群的有良好的预防和/或治疗作用的乙肝DNA疫苗,带来疫苗领域的又一次划时代变革.

　　

　　5 参考文献 （略）