作者：第四军医大学唐都医院肝病中心 张野 贾战生；深圳市汉科生物工程研究所 张明杰
肝细胞癌（hepatic carcinoma，HCC）是常见的消化系统恶性肿瘤之一，起病隐匿、发展迅速、病死率高。特别是由于HBV和HCV流行的原因，HCC的发病率和病死率仍在连年上升。在我国，每年死于HCC的患者约11万，其病死率已经上升为农村和城市恶性肿瘤病死率的第一位和第二位。
对大多数不合适手术治疗或经皮注射酒精或放射类局部消融技术的HCC患者，可以采用肝动脉栓塞化疗（transcateter arterial chemoembolization，TACE）或全身化疗。但由于HCC患者常伴有肝硬化，而肝硬化影响药物的代谢及活性，所以现有的抗HCC化疗药普遍因毒副作用限制了其抗癌疗效。虽然索拉非尼已经证实能够明显延长晚期肝癌患者的存活率（约3个月），但因其在老年患者中药物不良反应的发生率较高，同时对索拉非尼治疗无效的患者，目前还没有二线药物可选，加之药物经济学的因素，限制了索拉非尼在我国的应用。
因此，目前急需能延长晚期HCC患者存活期、减少不良反应的新药，并建立有效的预防措施来预防HCC的发生及复发。免疫治疗对HCC具有很大潜力，研究表明，HCC的发生、发展、转移和复发与机体的免疫系统有密切的关系。如何打破机体免疫耐受、激活机体杀伤肿瘤的功能，是当前HCC免疫治疗的主要方向，而细胞免疫治疗是其中的重要组成部分。细胞免疫治疗可分为主动免疫治疗和过继性免疫治疗两大类。本文主要就近年来HCC免疫细胞治疗的研究进展作一综述。
1、主动细胞免疫治疗
主动免疫治疗是指给患者回输能在体内激发特异性抗肿瘤免疫的细胞，启动自身免疫保护机制，达到治疗肿瘤或预防复发的目的。主动免疫治疗的作用范围广泛、副作用较小、作用时间较长，主动免疫细胞治疗主要包括：树突状细胞（DC）治疗和自然杀伤（NK）细胞治疗。
1.1 基于DC的HCC免疫治疗 DC是功能最强的抗原递呈细胞，在以DC为基础的肿瘤细胞免疫治疗方案中，DC的抗原递呈功能是T、B细胞发挥免疫反应的先决条件，借助DC高表达的主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类分子所递呈的肿瘤抗原肽，联合CD80、CD86及CD40分子共同作用，加载肿瘤特异性抗原的DC疫苗可以刺激特异性T细胞应答，促进肿瘤特异性T细胞在肿瘤部位聚集，发挥免疫功能。HCC患者接种DC疫苗后，可以增强NK细胞活性，下调调节性T细胞（Treg）比例。由于DC疫苗治疗的特异性和在体内免疫效应维持时间长等优点，目前已成为研究热点，并在肝癌治疗中显示出良好的应用前景。
已有研究证明，自体移植DC可使终末期肝癌患者的整体生存时间延长。在15例患者中，2例患者得到了进行部分放疗的机会，9例患者病情稳定，4例患者疾病进展，在治疗4个月内死亡，但自体移植DC的整体安全性和耐受性良好，为终末期肝癌患者提供了控制疾病和延长生命的机会。而目前的研究主要集中于如何增强DC的抗原递呈功能，使其发挥更强大的肝癌细胞杀伤功能，主要包括应用外源性化合物刺激DC、转染肿瘤抑制分子或免疫增强分子及加载肿瘤抗原的方法。利用双磷酸盐氨基酸化合物（aminobisphosphonate）唑来膦酸盐（zoledronate）刺激的DC可以在培养细胞中产生大量的异戊烯焦磷酸，使Vγ9Vδ2 T细胞分泌大量的干扰素（IFN）γ，使Vγ9Vδ2 T细胞的细胞杀伤功能增强，促进HCC患者和结肠癌肝转移患者肿瘤细胞的坏死和凋亡。将HCC患者分离的DC应用链球菌来源的抗肿瘤免疫治疗分子OK432联合白细胞介素（IL）4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激培养2d，应用TACE注入肝脏中。OK432刺激的DC可使患者在血清中产生高水平的IL-9、IL-15、肿瘤坏死因子（TNF）α以及趋化因子CCL4、CCL11，延长肿瘤复发时间和患者寿命。应用串联重复的微生物热休克蛋白70（heat shock protein 70）407-426表位肽联合OK432刺激DC较单独刺激产生更高水平的的DC表面分子（MHC-I类分子、MHC-II类分子、CD40、CD80、CD86和CDllc），增强Th1型细胞因子（IL-12、TNFα和IFNγ）的表达、诱导高水平的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）增殖和分化，并可有效抑制荷瘤小鼠的肿瘤增殖，延长小鼠寿命。利用腺病毒载体分别将人肿瘤内皮标志物（tumor endothelial marker，TEM）8和父方来源而母方印记的遗传印记基因PEG（parternally expressed gene）转导入DC中，两项研究均发现，转导的DC可有效诱导抗HCC的CTL增强，促进IFNγ的分泌，杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。多种方法均可以使DC加载抗原，包括肽脉冲、全蛋白加载和基因工程等。DC加载肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1或肿瘤细胞来源的自噬体DRibbles后可更有效的刺激T细胞增殖和杀伤活性。一项应用DC加载多个肿瘤相关抗原（包括甲胎蛋白、磷脂酰肌醇蛋白聚糖和黑色素瘤抗原基因-1）治疗HCC的I/II期临床试验发现，此DC疫苗在5位受试者的6次免疫中均有良好的安全性和耐受性，5位受试者均产生可针对肿瘤相关抗原的T细胞应答，但仅有1位患者获得了临床应答。虽然DC疫苗的研究是目前的热点，并已经进入临床试验阶段，但由于DC疫苗的制备工艺标准不统一，输注途径多样，导致了不同研究的DC免疫治疗效果不尽相同。因此，应尽快完善DC疫苗的质量控制和治疗的标准化路线图，以期使DC治疗尽早在临床工作中得以广泛应用。
1.2 基于NK细胞的肝癌细胞免疫治疗 NK细胞为固有免疫系统中的重要成员之一，具有抗感染和抗肿瘤功能。NK细胞的作用可以是直接的，不需致敏就可通过释放穿孔素和颗粒酶而杀伤靶细胞。同时，NK细胞也产生细胞因子（如IFNγ和TNFα），发挥免疫调节作用。这为以NK细胞为基础的免疫治疗或疫苗开发带来了希望。
目前针对NK细胞的抗肿瘤主动免疫细胞治疗方案主要包括利用外源性化合物刺激NK细胞和利用基因修饰技术增强NK细胞功能等。应用重组共表达GM-CSF、IL-21和维甲酸早期转录因子-1（ribonucleic acid export-1，Rae-1，是NKG2D的配体）的DNA疫苗免疫肝癌小鼠模型，此疫苗免疫后可有效的提高NK细胞和CTL的数量和功能活性，同时降低Treg的表达，进而促进IL-2和IFNγ的分泌，减缓肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存时间。而索拉菲尼也可以通过调节巨噬细胞和NK细胞的相互作用发挥抗肝癌作用。在HCC肝移植治疗过程中，同种异体的NK细胞可以发挥适应性免疫治疗的作用，供体肝脏内的NK细胞在一定处理条件下可以发挥免疫活性治疗的作用，IL-2刺激的肝脏NK细胞具有较强的细胞毒性，表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）并分泌IFNγ，发挥抗HCC的功能。而Jiang等利用基因修饰技术，构建了人IFNα基因修饰的NK细胞系，命名为NKL-IFNα细胞，此细胞系可稳定分泌IFNα，并对NKL-IFNα细胞在体外和体内针对HCC的自然杀伤功能进行了分析。研究发现，NKL-IFNα细胞对原代人肝癌细胞具有更强的细胞杀伤活性，这可能与NKL-IFNα细胞上调了细胞毒性相关基因表达（如穿孔素、粒酶B、Fas配体等）有关。同时，NKL-IFNα细胞分泌的细胞因子TNFα和IFNγ也可诱导HCC靶细胞表面Fas的表达增加，使HCC细胞对NK细胞介导杀伤作用的敏感性增强。更为重要的，NKL-IFNα细胞可抑制异体肝癌动物模型中HCC肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存时间。因此，IFNα基因修饰的NK细胞可作为肝癌细胞免疫治疗的新方案。然而，目前有关NK细胞治疗HCC的临床试验研究目前较少，这可能与NK细胞非特异性的杀伤作用可能导致正常组织器官损伤、NK细胞体外培养条件的限制等因素有关。
2、过继性细胞免疫治疗
过继性细胞免疫治疗是指给患者回输经过体外激活和扩增至一定数量后具有内在抗肿瘤活性的自体免疫细胞，在体内发挥杀伤肿瘤的作用。过继性细胞免疫治疗方案主要包括：淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cell，LAK 细胞）、肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK细胞）等。
2.1 LAK细胞治疗 LAK细胞是将外周血单个核细胞在体外经高浓度IL-2培养4～6d后诱导的一种非特异性的杀伤细胞，这类细胞可以杀伤多种对CTL、NK细胞不敏感的肿瘤细胞。目前尚未发现LAK细胞特有的表面标志。许多研究表明，LAK细胞的前体细胞是NK细胞和T细胞。在肝癌治疗方面，LAK细胞治疗主要辅助应用于手术治疗后。Kawata等比较了阿霉素联合LAK细胞+IL-2对肝癌手术切除后患者生存率的影响，4例患者随机分为两组，分别接受LAK细胞+IL-2+阿霉素或单独接受阿霉素的治疗。在手术过程中，患者的脾脏被切除用于制备LAK细胞。患者术后1、2、3年的生存率分别为91.7%、82.9%和72.5%，略高于单纯手术切除组。但两组患者在总体生存率和累计无病率方面均未见统计学差异。镤利宇等也对肝癌根治性切除术后TACE联合LAK细胞+IL-2肝动脉灌注应用进行了研究。结果联合LAK细胞+IL-2的患者在术后1、2、3年肝内复发率较仅TA-CE的患者明显降低，2年和3年生存率提高。
2.2 TIL治疗 TIL是将手术切除的肿瘤组织内分离浸润的淋巴细胞使用IL-2进行体外培养而产生的一类新型杀伤细胞。TIL的表型具有异质性，TIL中绝大多数细胞呈CD3阳性。不同肿瘤来源的TIL中，CD4+T细胞、CD8+ T细胞的比例有差异，大多数情况下以CD8+T细胞为主。NK细胞的标记（CD16、CD56）在TIL体外加入IL-2培养过程中有先增高后降低的趋势。TIL的抗肿瘤活性是在肿瘤生长过程中产生的，是肿瘤抗原特异性T细胞。TIL的杀伤活性较LAK细胞更强，但其具有MHC限制性，同时TIL回输治疗存在肿瘤细胞自体回输的风险，限制了其临床应用，相应的临床研究报道也较少。将用IL-2和CD3单克隆抗体活化的TIL经肝动脉输注给3位肝癌患者，观察TIL在体内的分布。结果发现，TIL聚集在肝脏，且持续时间达48h。在使用含有TIL的化学免疫治疗后，3位患者中有2位出现部分疗效。
2.3 CIK细胞治疗 CIK细胞将人外周血单个核细胞应用多种细胞因子共同培养后获得一群细胞，同时表达CD3和CD56，又被称为NK细胞样T淋巴细胞，CIK细胞可以通过直接杀伤、释放大量炎性因子以及诱导肿瘤细胞凋亡的作用杀伤肿瘤细胞，具有增殖速度快、杀伤活性高、杀伤肿瘤谱广泛、对正常组织细胞的复兴小以及对多重耐药的肿瘤细胞依然敏感等特点，被认为是新一代抗肿瘤过继性细胞免疫治疗的首选方案。Takayama等将150位HCC患者手术后分成接受或不接受IL-2及抗CD3活化的CIK细胞过继性免疫治疗，结果发现过继免疫治疗降低了复发率，延缓了第一次复发的时间。同时，CIK细胞治疗组明显延长了无复发存活期及疾病特异性存活，但两组之间的总体存活率并没有明显差异。在我国，王福生教授等率先进行了有关CIK细胞治疗原发性肝癌的研究。应用IFNγ、IL-1、IL-2和CD3单克隆抗体共同培养外周外单个核细胞（PBMC），使其诱导成为CIK细胞，在培养21d后，CD3+CD56+细胞可占19.0%～20.5%，在培养28d后，CIK细胞的数量可增殖300～500倍。在动物实验中，CIK细胞抑制肿瘤生长的能力较LAK细胞及PBMC过继性治疗均显著升高。而最近的临床研究也对CIK细胞过继性治疗在肝癌中的临床疗效进行了观察，而一项大样本的研究针对410例HCC患者在手术后是否进行CIK细胞治疗对生存期的影响进行了分析，手术后接受CIK细胞治疗的患者总体生存率较单独接受手术者明显升高，而CIK细胞治疗是一项独立的预测因素。同时，接受超过8个循环CIK细胞治疗的生存期较小于8个循环的患者长；在肿瘤直径超过5cm的患者中，接受CIK细胞治疗的患者生存期较单独接受手术治疗的患者生存期长。Wang等应用（3.2～3.6）×109个CIK细胞对终末期原发性肝癌患者进行的腹腔灌注，2次/周，灌注2h后进行局部放疗，间隔1个月后再次进行治疗。共有31例患者接受了平均（4.2±0.6）个疗程的治疗，随访时间为（8.3±0.7）个月，在接受CIK细胞联合局部放疗后，患者外周中CD4+、CD8+和CD3+CD56+细胞均显著升高，AFP水平和腹围均降低，疾病控制率为67.7%，平均生存期为8.5个月。Huang等对TACE+RFA+CIK治疗HCC的疗效与TACE+RFA的疗效进行了对比，疾病控制率在TACE+RFA+CIK治疗中可达95.3%，且均有更长的总生存期和无病生存期。但由于此项研究的人组患者并非随机分组，因此疾病轻重、患者的年龄、既往疾病病史等因素均未列人统计中，所得出的结论仍有待进一步证实。而最新的一项临床荟萃分析发现，CIK细胞治疗能够延长接受TACE或RFA的HCC患者的生存期。
3、基于改善肿瘤免疫微环境的细胞治疗
肿瘤微环境是肿瘤在其发生发展过程中所处的内环境，由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及浸润细胞共同组成。肿瘤微环境内存在许多因素可参与肿瘤组织和免疫细胞的相互作用，包括局部效应细胞功能障碍、细胞因子的免疫调节作用、配体-受体反应以及T细胞代谢活性的调节等。肿瘤微环境是动态的，随着肿瘤的发生、发展以及治疗干预发生着变化，同时具有显著的异质性。肿瘤微环境，特别是肿瘤免疫微环境（包括抗肿瘤的免疫效应细胞和分子以及免疫抑制性细胞和分子）对于肿瘤的发生、发展和临床转归具有重要的作用，针对肿瘤免疫微环境的细胞治疗也成为了目前研究的热点之一。
肝脏免疫微环境的组成复杂，其中，固有免疫主要包括Kupffer细胞、肝血窦内皮细胞以及肝脏内的NK和NKT细胞，Kupffer细胞和NK/NKT细胞分泌多种抗病毒和抗肿瘤的细胞因子。而DC可进行抗原递呈，活化初始T细胞，介导适应性免疫应答。肝星状细胞在成瘤过程中活化，引发细胞外基质的迁移和分泌。肝细胞还可分泌I型IFN，保护临近的肝细胞免受感染和避免肿瘤的发生。细胞治疗可对HCC的免疫微环境产生影响，过继性T细胞免疫治疗可使转移的T细胞在肝癌局部增殖，提高微环境中杀伤性T细胞的数量，在进行过继性转移的同时，还可以联合给予抗抑制性分子的抗体，阻断免疫抑制PD-1或LAG3的信号通路，破坏肿瘤的免疫抑制微环境，提高抗肿瘤免疫应答。而目前直接针对肝癌免疫微环境的细胞治疗方案尚未见相关报道，进一步研究可直接针对肿瘤微环境的细胞免疫治疗方案，以期打破肿瘤微环境中的免疫抑制，为肿瘤的治疗提供新的策略和方案。
4、展望
虽然在临床试验中至今还没有看到对HCC患者具有显著抗癌作用的免疫活性细胞治疗，但从本综述的资料中可以看出，主动细胞免疫治疗和过继性细胞免疫治疗既具有改善存活率又不损害生活质量的潜力，还有望预防复发。同时，为了证实免疫活性细胞治疗的有效性，必须认真分析临床与免疫应答之间的相关性，并设计出能够评估新的免疫治疗或联合治疗的方案，从而为进一步开发合理而严谨的临床试验提供指导，为HCC的细胞免疫治疗提供有意义的临床试验资料。