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乙肝病毒变异与临床

更新时间:2002年10月22日00:00:00    作者:战胜乙肝网    文章来源:赛洛金药业
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上海第二医科大学瑞金医院临床病毒研究室(200025) 陆志檬 张欣欣 01-12-4

   病毒变异是生物遗传进化的基本因素之一,乙型肝炎病毒(HBV)变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的,也可于应用药物或接种疫苗后。HBV在复制中通过RNA中间体,在DNA-p和逆转录酶活性是有效而迅速的,但DNA-P缺乏校对酶活性,发生核苷酸替代变异后难以修正。已发现HBV序列的变异在基因组各个区域均可发生。不同的病人表现为不同的基因型,最近已确定HBV有7个基因型(A-G),并与地理因素相关。在美国和欧洲主要是基因型A和D。B和C主要在中国和东南亚。已发现基因型与临床预后和治疗反应相关。基因型在漫长的岁月中突变累积形成的基因组结构,在这里的变异是指基因型以外的变异,包括HBV的前C/C、X、前S/S和DNA-P多个区域均可发生突变、插入或缺失、移框突变等,通常把病毒株分为野毒株(wide strain)和变异株(variation strain),一些变异株对临床预后和病毒学反应具有重要意义。现分述于下。

   前C/C基因变异

   前C1896位(A83)的变异:是HBV中最常见的变异。1989年英国学者Carman等首次报导了HBV前C1896位的突变。野毒株1896位是G,变异为A,A83氨基酸(TGC)变异为终止密码(TAG),使前C蛋白的翻译终止,从而使eAg不能合成,但它并不影响报道复制,因此临床上表现为HBeAg(-)、HBV-DNA(+),而病人仍处于活动状态的慢性乙型肝炎。进一步研究该变异的分子基础发现前C区含一个发夹形纤襻结构,在1858位与1896位间,将不稳定的T-G对(与基因型有关)变异为T-A对,使前基因组RNA结构更稳定,更有利于病毒复制,并可导致优势株。

   在分析HBV变异的临床意义时,可从慢性HBV感染者的动态血清学、临床表现与前C区变异关系时发现慢性感染HBeAg(+)期,病毒高滴度,但临床常无加重。随着感染持续,出现了HBeAg(-)前C变异株,并逐渐累积,此时血清学仍可为HBeAg(+),但血清中已可同时检测野毒株和变异株,其中野毒株逐步被清除,临床上常伴肝炎发作;随着前C1896变异株选择优势的发展,血清学可转换为HBeAg(+),但在血清中仍可检测到HBeAg分泌的野毒株,在临床上既可表现为病情加重,也可表现为病情缓解;若选择的结果进入均一eAg不表达的变异株,则ALT可轻微升高,但病情可无明显加重。

   总之,在慢性HBV感染过程中,野毒株和eAg(-)变异株的并存,常与疾病的加重有关。相反 ,在病情稳定的患者中,仅发现单一的野毒株或HBeAg(-)的变异株。有关eAg消失后前C区变异与病情活动,国内外已有不少相关报导。但对此也有不同观点,认为前C区变异是普遍现象,与疾病严重似无明显相关。这可能涉及变异分析技术因素,包括方法敏感性、定量分析、动态观察或定量分析等。

   前C1896位(A83)和1899位(A86)的双变异:在HBV前C1896位(A83)变异常伴随1899位(A86)变异。即在1899位的G→A变异。这样就连成一个短序列为TAGGA。已发现该变异可能增强核糖体的结合,使核壳蛋白可活跃转译,认为1899位变异是1896变异代修性措施。这种双变异具有优势选择,使HBV有较高复制水平和传染性。

C基因的变异

   近几年来几项研究表明在病毒清除期,基因组较保守的部位发生了选择性变异,以C区中部的变异或缺失,特别是错义变异至少可涉及4个B细胞靶位、2个细胞毒T细胞(CTL)表位和3个Th细胞表位。

   C区的变异与临床相关性研究:在codon 130的变异是T、B细胞共有的表位。A Okumara分析了变异株(Core 130 Thr)和野毒株(Core 130 Pro)在慢乙肝中与肝损害关系,结果表明在5例慢乙肝,病情加重,ALT升高时C130(Pro-Thr)变异株占优势,而在ALT高峰下降后野毒株为优势,而在3例慢性携带者野毒株(C 130 Pro)始终占优势。作者认为HBVC区Codon 130是最重要的免疫原性区,Thr/Pho比值的增高是免疫筛选的表位和B细胞表位和HBc/e抗体结合决定簇、CD4+细胞Th细胞和B细胞识别区段,可部分逃避免疫反应,使肝脏损害持续存在,常与前C区终止变异同时发生或在前C变异后再出现,与进展性抗e(+)慢性肝病相关。隋礼丽、骆抗先等研究了HBV/C基因变异对宿主细胞HLA表达的影响,结果发现:V60、G87和L97变异株与野毒株相比可增强HLA的表达,从而可解释CTL对宿主细胞杀伤性增强,是病毒变异和疾病进展相关原因之一。

X基因的变异

   X基因是病毒复制的重要调节区,是转录、反转录和正链合成的起点,也是多种细胞因子结合点,此区变异影响到病毒的转录和复制。研究较多的是核心蛋白的启动子(CP)。

   慢性乙型肝炎BCP区的变异:BCP的变异是多点和复合的,主要是1762(A-F)、1764(G-A)的双变异,BCP区是富含AT区域,具有肝脏富含因子的独立结合点,变异的BCP可改变这种结合,降低前C的RNA转录,最终使HBeAg表达减少,平均降低70%。BCP的变异还可增强前基因组RNA转录增强(2~3倍),病毒包装有很大增强(10×)。

   最近对3P启动子CCTTA附近的缺失变异可影响24KbPre-S1mRNA和21KbSmRNA的转录表达,与外科肝移植后发生胆汁性淤积有关。HaLee则发现在Pre-sp转录起始编码的缺失。

   目前认为X基因区BCP、SP或PreSP的变异改变了HBV基因表达的平衡,与HBV持续感染相关。

   暴发型肝炎患者CP1638位(T-C)、1673位(C-T)、1727位(A-T)、1730位(C-G)变异:出现较多。Sato等发现在暴发型肝炎或急性自限性乙肝中,CP和前C区联合突变或单独出现,尤其是A基因型优势株地区所发生暴发型肝炎有意义。

前S/S基因变异

   HBV包膜蛋白是宿主体液和细胞免疫反应的靶位点。前S/S变异可使HB疫苗或HB免疫球蛋白保护无效。有些部位的变异还步及血清学标志的改变而影响诊断的灵敏度。

   乙肝疫苗免疫后仍出现HBsAg(+)的小儿中,发现了HBsAg"a"决定簇的变异株,可有一点或多点变异,其中最重要的突变是145位的甘氨酸替代了精氨酸,这是由于HBV逃避宿主的免疫压力选择性结果,有时这种变异株在母体内为少数,而在疫苗免疫后的小儿却成为优势株。在肝衰竭进行肝移植后应用单克隆抗体或高效价HBeAg治疗后也可出现HBeAg变异,这些突变大多数发生在"a"决定簇145位的甘氨酸-精氨酸。

   还有报导则在HBeAg(-)、HBV DNA(+)患者中发现124位半胱氨酸缺失,导致HbeAg的分泌障碍,而使免疫学标志出现HBeAg(-)。

P基因变异

   P基因是最长的开放读框,与C、S与X基因重叠。P基因主要编码DNA-P,该基因共分成5个区(A、B、C、D和E)。这些区域是较保守的,参与核苷酸或模板结合,并且具有催化活性。近年来,在用核苷类药物治疗患者中,出现了P基因突变的报道,体内外试验表明这些突变株与药物耐药相关。

   拉米呋啶引起YMDD突变:拉米呋啶(Lamivudine,LAM)是当前HBV治疗广泛应用的核苷类似物,它能显著降低HBV DNA水平(4~5logs),并可使ALT正常化和肝组织学改善。若长期治疗,则在DNA-P的保守区(C)的YMDD基序发生变异。目前认为变异的耐药机制是由AA552的蛋氨酸被颉氨酸或异亮氨酸替代(即M552I/U),使此链缩短,结合点变大,不再适合拉米呋啶结合而导致耐药。

   LAM引起YMDD(C)和B区的联合变异:除YMDD为主要变异外,常合并上游(B)的L528M的变异。根据不同的变异形式可分成三组(图)。

   HBV-DNA聚合酶
   氨基酸序列 ……FLLAQ………………YMDD……
   密码子528552
   Ⅰ组变异↓ Lto M↓M to V/l
   ……FLMAQ …………… YVDD……
   Ⅱ组变异YIDD ……
   Ⅲ组变异 ……FLMAQ …………… YIDD ……

Y=酪氨酸 M=蛋氨酸 D=天冬氨酸 L=亮氨酸 V=颉氨酸 I=异亮氨酸

   

   最近研究(Hepatology,2000,1318-26)表明在LAM长期治疗中可有HBV-YMDD变异株被清除,还可出现新的突变株来取低YMDD变异株,如A529T,在表面抗原基因产生终止密码,导致HBeAg分泌减少,体外试验表明对LAM耐药,这些变异也可引起持续性慢性肝炎的发作。张欣欣,刘传苗等发现在LAM治疗过程中,血清HBeAg发生转换,但HBV DNA仍(+)者,检测其pre-c 1896位变异导致终止密码,并常可联合YMDD变异(待发表)。

   LAM治疗和肝炎突发:在美国和亚洲二个LAM临床试验报告了HBV DNA下降了2~3个logs。二年的HBeAg阴转率为27%,YMDD的发生率分别为32%和14%,但随着治疗的延长,在亚洲40%发生了LAM的耐药变异。LAM相关的ALT突发见于服药期间变异株患者,有部分患者停药后也发生了复发。

   台湾Liao对55例病人经LAM治疗104周,其中32例(60%)检测出YMDD株,变异率为58.2%。32例变异者中有30例出现ALT的升高(93.7%)。其中13例(40.6%)出现肝炎急性发作。在发作前HBV DNA水平升高至顶点,在1~4周后ALT升高达顶峰(247~2010U/L),发作后8例出现eAg阴转,3例出现失代偿,但在血清eAg转换后,病情恢复。作者认为YMDD变异株出现急性发作或急剧变化可导致HBV清除,其病程和临床病理特征与HBV野生株慢性感染相似。

   对LAM耐药致肝炎急性发作的理解,认为应从HBV感染的免疫致病机理包括宿主的免疫因素和病毒的复制。慢性HBV感染者常显示抗病毒T细胞免疫的低反应性。在发作前可先观察到一个高的病毒滴度,接之可激活抗HBV细胞免疫反应,此免疫反应直接针对感染的肝细胞,导致肝细胞坏死和临床肝炎表现。当体内耐药变异株增多,复制增加时,也可激发机体免疫反应引起临床肝炎的突发。若强有力的免疫反应能控制病毒的复制,则结局是病毒清除(eAg转换,HBV DNA消失)和疾病恢复。如果免疫反应不足以消灭病毒,则肝功能可持续异常。由于LAM是一个直接抗病毒的药物,机体内在的免疫反应十分重要,治疗前ALT增加5~10倍治疗结局良好。因此LAM长期治疗后YMDD变异株发展后,内在的细胞免疫反应也决定了是否发生肝炎发作及其肝损害的程度。

   YMDD耐药变异的防治:随着用药时间的延长,核苷类药物易引起病毒变异,导致耐药。为了减少耐药性的出现,一方面可以联合用药。从理论上讲,IFN和核苷类药物在不同的靶位点联合应用,可减少耐药株的出现。Schalm等报道称230例患者随机分成3组(INF、LAM、LAM-IFN),结果52周时的三组HBeAg阴转率分别为19%,18%和39%。联合治疗的疗效更明显。但对此也有相反意见,在美国、加拿大、欧洲进行的IFN和LAM联合治疗疗效也不佳。有人报道,对LAM耐药株M5522变异可用LAM-FAM序贯治疗可抑制病毒复制,但不同意见者认为FAM在P区也可出现L528M变异,该药所出现的P区其他突变V521L,P525L、W501E等,亦可引起肝炎突发。阿德福韦是一个广谱的抗病毒药物。在HIV治疗过程中未发现有耐药变异。Xiong等重组含有M512I、M512V、L528M、M552V变异的HBV株,对LAM耐药的阻滞常数较野毒株增加了8.0、19.6和25.2倍,但所有变异株对阿德福韦均敏感,且对联合变异也有效。

   对于YMDD变异导致急性发作和病情急剧变化是否继续应用LAM,一般认为LAM对野毒株继续有效,应继续用药,但在LAM变异株产生病情急剧变化,特别SB>50μmol/L时应予停药。最近,omeya T报道了一例LAM耐药引起急剧变化时(SB 4.9mg/L,ALT 1230IU/L,HBV DNA 68Meq/ml)继续应用LAM同时加用IFN-α使变异株清除,LAM使变异株清除,从而使病情缓解。

   结语:HBV变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的,在HBV前C/C、X、前S/S和DNA-P多个区域均可发生变异。有些变异并无生物学意义,但有些变异经体内外试验证实是与临床相关的。在长期应用核苷类药物中,HBV的变异也会不断发生,需动态监测变异的发生、发展与临床关系。在治疗策略上,可针对HBV复制过程的靶位点,开发新的药物,并设计联合治疗。

  注:本站原刊登有该文摘要版,现根据网友“拉米夫定”在战胜乙肝论坛提供的全文内容更新本篇文章。

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