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乙型肝炎诊断治疗的一些进展-罗显明

更新时间:2002年08月24日18:25:00    作者:战胜乙肝网    文章来源:广东省疾病预防控制中心
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  ( 广州市传染病院 罗显明主任医师 )

  自1965年Blumberg等发现当时所谓“澳大利亚抗原”,1970年Dane等在电镜下鉴定了Dane颗粒,并阐明了病毒颗粒表面成分HBsAg、核壳成分HBcAg和HBeAg。检测HBV感染的方法学迅速建立。随后限制酶切技术和DNA重组技术的应用,成功克隆了HBV的主要亚型。尤其是1985年建立聚合酶链反应(pCR)技术。并迅速在乙型肝炎研究方面广泛的应用和关于HBV变异方面的研究,使乙型肝炎的免疫学、病理学、临床医学和流行病学等方面的研究提高到分子水平。

  病原学和相关检测技术的进展

  HBV完整的毒粒首先由Dane等描述,亦称Dane颗粒。电镜下呈双层外壳的园型颗粒。直径约42nm。核心颗粒为直径约27nm的20面体。核心中含病毒DNA基因组、DNA聚合酶、蛋白激酶活性和连接DNA末端蛋白(图1)。

  HBV基因组是一个约有3200碱基的小环形的双链DNA结构(正链和负链)。HBV负链的核苷酸序列至少有4个开放读架(ORF),分别为编码核壳的C基因、编码聚合酶的P基因、编码外膜蛋白的S基因和调节病毒基因转录水平的X蛋白。

  S-ORF编码合成HBV的外膜蛋白,其中主要是主蛋白,即HbsAg;中蛋白是在主蛋白氨基酸端扩加55个氨基酸,即前S2;大蛋白是在中蛋白的氨基酸端再矿加108-119个氨基酸,为前S1。外膜蛋白中的主蛋白由(HBsAg)在装配完整的病毒及分泌中起主要作用。前S1蛋白具有高度活跃的细胞内吞饮作用,HBV以前S1区为结合部位,使病毒附着于肝细胞上,传染肝细胞。前S2蛋白的羟基端序列对蛋白酶高度敏感,可被许多蛋白酶裂解,融合序列暴露而与细胞膜结合而侵入肝细胞。HBV通过前S2蛋白与单体人血清蛋白联结而稳定在血循环中,逃避抗病毒免疫应答,有助于病毒血症的持续。

  C-ORF编码C基因分前C区和C区。前C区上游不包裹进核心,编码HbeAg,HbeAg可引起免疫耐受,在HBV的母婴传播后,HbeAg是小儿长期保持免疫耐受状态的稳定因素。HbeAg阻断细胞毒性T淋巴细胞,将免疫攻击由感染的肝细胞移开,使HBV逃避免疫清除,得以在HBV携带者中长期贮存。大部分病人血清中含有3种HbeAg分子,在病毒清除后血清出现抗Hbe转换,其对α干扰素治疗均有效应。而仅含一个分子的HbeAg,一半以上对干扰素治疗无效应。

  前C区的下游和C区经拼接编码HbcAg。C基因附近区段是HBV复制的关键性部位。HbcAg可自行装配27nm的20面体核壳。在病毒成熟过程中,核壳与外膜互相作用,形成病毒颗粒分泌的信号。

  P-ORF在HBV DNA序列中P基因是最长的开放读架,P基因产物是一个含约816个氨基酸的多蛋白。在HBV RNA的反转录需要几种功能:RNA包装、DNA合成引导、在RNA和DNA模板上DNA聚合以及在RNA-DNA杂交体中RNA的消化,这些功能主要由P基因的编码蛋白来完成,P蛋白几乎参与病毒复制的全过程。

  X-ORF、因其在病毒生命周期中的功能尚未充分阐明而称之为X基因。HBx蛋白可激活细胞的原癌基因和改变细胞的生长特性,可能与肝癌发生有关。

  病毒是生物适应环境的重要方式,病毒在传染过程中经历难以计数的传代,因而最常发生基因变异。变异病毒可逃避自然发生或疫苗产生免疫、对药物产生耐药性、改变发病机制,甚至改变种属和组织的嗜性。过去对HBV感染常以不同的免疫状态来解释不同的临床现象。近年由于分子病毒学的进步,发现不同的免疫状态不仅取于感染者本身的遗传素质,亦与病毒的分子状态有关。变异病毒的异常表达引起宿主的异常应答,使血清标志物出现不典型现象。HBV的变异广泛存在于基因组的不同部位。其中最常出现在前C区、C区基因、S基因的某些特定位点。例如因α干忧素、拉米呋啶等治疗常引起前C区的变异而影响疗效,前C区变异后不再产生HbeAg而引起血清标志物改变。HbeAg作为一种免疫调节因子可抑制T细胞的细胞毒活性,前C区Ca83变异不再生HbeAg失去了血清HbeAg的调节表达HbcAg 肝细胞经受增强的T细胞的细胞毒作用,病变常较严重。如变异发生在C前AA15(脯氨酸为丝氨酸所代替),不影响HbeAg产生,可出现HbeAg㈩、抗Hbe㈩。如起始密码ATG变异HbeAg缺失,HbcAg表达却增强,则这类变异病毒可逐渐被T细胞清除。

  除前C区外,其他的基因都可以发生变异,而影响临床过程及出现检测血清标志物的不典型现象。

  不典型的血清学表现

  一、检出单一的HbsAg:见于急性HBV感染的最早期。一般随后出现HbeAg和IgM抗HBc。

  在慢性HBV感染中,95%HbsAg和抗HBc并存。有少数不出现抗HBc主要是由于宿主选择性免疫缺陷,缺乏HbcAg特异性T细胞,对HbcAg无应答。

  二、检出单一抗HBs:注射HB疫苗或高价乙肝免疫球蛋白后出现单一抗HBs是正常现象。但在未接受上述注射的人群中少数可检出单一抗HBs则要注意。因为HbcAg比HbsAg的免疫原性强,所以抗HBc比抗HBs滴度高得多。这类单一检出的HBs可能是IgM型,这种IgM型抗HBs常无保护性,仍可发生HBV感染。

  三、HBsAg和抗HBs并存:在慢性HBV感染者中约有3%~5%两者共存。可能由于①前后感染两种亚型HBV;②S基因变异,其编码的HBsAg抗原性改变,原型抗HBs不能将其清除;③接受α干忧素治疗中出现抗HBs血清转换,但由于S基因的变异,而未能清除HbsAg。

  四、HBeAg(+)而HBsAg(-):罕见,曾有报导d在接受α干忧素治疗中出现C基因区的短暂整合。亦有发现由于S基因变异,α决定簇前有插入性变异所致。

  五、抗HBc(-):HBcAg是HBV免疫原性最强的抗原,HBV感染后,抗HBc通常有较高的滴度和持续时间较长,但有些感染HBV后可不出现抗HBc。可能是由于宿主选择性免疫应答不全;此外在种族中也有较大差异;在一些HBV高复制的携带者中,因被过量的HBcAg所掩蔽而出现抗HBc(-)。

  六、检出单一的抗HBc:①假阳性,抗HBc假阳性可达30%。②感染后恢复,急性感染的“窗期”仅出现抗HBc,主要是IgM抗体,随后应出现抗HBs,如少数患者可因免疫应答较低而未产生抗HBs。通常感染后同时存在抗HBc和抗HBs。但抗HBs可先消失而单存抗HBc。这种情况注射乙肝疫苗大多可产生回忆性免疫应答。③低水平感染状态,在单一抗HBc(+)慢性肝炎病人中60%以上可检出HBV DNA,在单一抗HBc(+)的“健康”人中有30%可检出病毒。抗HBc滴度检测亦可区别是感染状态或是免疫状态。仅原血清(+)者几乎均为过去感染;1:10(+)约20%可以PCR检出HBV DNA;1:100(+)者约50%;1:500(+)者90%;1:1000(+)者血清几乎均可检出HBV DNA。

  HbsAg(—)的HBV感染

  有人对615例“健康”献血员用PCR检测HBV DNA发现:

血 清 标 志 物

检测

例数

PCR(+)

HBsAg

抗HBs

抗HBe

抗HBc

例数

81

5

6.2

62

18

29.0

180

7

3.9

24

16

66.7

15

4

26.7

253

4

1.6

合计

615

54

8.8

  由上表可见所有血清标志物均阴性者尚有1.6%检出HBV DNA,而抗HBs阳性者仍有16例(2.5%)检出HBV DNA。上述数据只是HbsAg(—),且有病毒血症的HBV感染者。尚有一部分可能仅肝内有整合型的HBV DNA而无病毒血症,即使以PCR亦不能检出病毒。

  在各类HbsAg(—)的慢性肝病病人中有近半数的患者血清中检出HBV DNA。亦有少数长期ALT反复轻度增高,各类型血清标志物均阴性,甚至以PCR检测HBV DNA、HCVRNA等均阴性患者,经肝穿刺活检检出肝细胞内潜有乙肝或丙肝病毒。由此可见血清中未检出HbsAg,甚至未能检出任何血清标志物也不能排除HBV感染,只有用灵敏的方法检测肝内病毒才可能除外。而这些HBV感染者在流行病学上有重要意义,如果作为供血员危害更大。

  出现感染HBV而HbsAg(—)的原因可能是因病毒变异;病毒感染水平很低;检测试剂影响,国产试剂盒的灵敏度在ng/ml,而Abbott试剂盒可达0.1~0.2 ng/ml;宿主因素,可能是肝细胞中基因表达低或在某些情况下,如化疗、酒精性肝病等影响病毒颗粒组装或分泌,因而未能检出血清中HbsAg。

  由此可见,单靠血清标志物的检测,不足以确定是否存在HBV感染,血清HBV DNA是病毒复制的直接标志,目前常用作检测HBV DNA的方法有分子杂交(斑点)和聚合酶链反应(PCR)。斑点杂交法可检测105拷贝/ml的HBV DNA,可作检测样品中的HBV DNA半定量。此方法较简单,费用较低,但灵敏度也较低,且试剂不稳定,我们常在班点杂交法检测阴性的病例中用PCR检出HBV DNA。聚合酶链反应(PCR)是一种体外基因扩增技术。PCR有非常高的灵敏性。目前我们不但可以作PCR定性检测,也可以作定量检测。但其费用较高,且对实验操作、环境、器材、试剂的要求较高,容易出现由实验污染而出现假阳性。

  血清HBV标志物检测和病毒DNA的检测只能显示患者血液中病毒的携带情况,不能判断肝细胞的病毒携带状态,只有作肝穿刺检测肝细胞内病毒才可作出较准确的判断,尤其在使用抗病毒药物治疗后,血清HBV DNA阴转时,如何使用药物具有重要指导意义。此外在鉴别一些长期ALT轻度增高,而所有血清标志物和HBV DNA检测均阴性的患者的诊断是有很大帮助,最近我们曾对数例此类患者作肝穿刺活检,才发现其肝细胞内潜有乙肝或丙肝病毒,使多年不能确诊的患者得到正确诊断。

  对乙型肝炎,目前尚未有确切的根治方法,肝脏病变的进展与持续病毒复制有关。至今,仍未有一种抗病毒药物能清除肝细胞内的病毒,因此,抗病毒治疗的目标只能是阻断病毒的复制,清除复制的病毒。在众多的抗病毒药中,目前只有干扰素和拉米呋啶有一定的效果。

  干扰素抗病毒治疗

  干扰素(IFN)是一种分泌性蛋白,人体对异种核酸产生IFN普遍存于人体细胞,是人体一个防御系统。IFN基因不同,其表达产物按分子结构和抗原性可分为α、β和γ型。IFNα有20多个亚型。目前IFN制剂有自然的和重组的。人自然干扰素由外周白细胞、类淋巴母细胞或成纤维细胞制备,是多种α亚型的混合物。重组干扰素有α2 a、α1a、α2b等。

  IFN的抗病毒活性:①激活细胞的IFN激活基因,编码合成数种抗病毒蛋白,使细胞在数分钟内形成抗病毒状态,使病毒mRNA降解,从而抑制转译。②可使蛋白由转译的起始因子α亚单位磷酸化,从而抑制蛋白合成。

  IFN抗病毒活性的特点:

  ①仅仅是抑制作用,IFN消失后病毒可重新复制,因而必须足量反复应用。

  ②不直接灭活病毒,而是通过细胞基因组产生另一些蛋白因子来发挥效能,不同的细胞对IFN作用的敏感性不同。

  ③不同感染状态的病毒--细胞系统对IFN的敏感性不同。当病毒大量复制,引起细胞炎症应答时IFN易产生效应。对完整细胞中的整合型病毒无作用。

  ④IFN的作用范围较宽,能阻断病毒进入细胞;抑制病毒蛋白转译;抑制病毒增强子活性,降低病毒基因的转录水平;抑制病毒包装;最重要的是在感染细胞内降解病毒mRNA。

  剂量和疗程

  IFNα500万单位,3次/周×16周是较通行的方案。约有1/3病例HbeAg阴转,血清HBV DNA消失。如同时有ALT上升者疗效更佳。如治疗4个月后HbeAg和HBV DNA明显下降而未阴转者,宜继续治疗至两者阴转。疗程通常要6~18个月。

  疗效界定:

  完全效应:血清HBV DNA(斑点杂交)消失、血清HbeAg阴转、ALT正常或在正常值上限1.5倍以内、抗Hbe阳转。约40%慢性乙肝患者能达到此效果。但有近10%病人疗程结束后,虽然HBV DNA消失、ALT正常,而HbeAg仍可阳性,此类患者大约6个月~2年可出现HbeAg和抗Hbe的转换。约有10%病人观察4年以上HbeAg和抗Hbe、HBV DNA持续阴性者较不稳定,有再活动的可能。

  在IFN治疗中,HbsAg仅有10%~15%清除。多出现在感染时间较短和年龄较大的病人。一般在3个月至数年内出现HbsAg清除。

  作为全效应标准的“HBV DNA消失”是以斑点杂交法判定,是事实上在HbeAg消失6~12个月,PCR检测仍有约85%病人血清中可检出HBV DNA。5年随访多数还可在肝组织中检出少量残存病毒,此微量的病毒有可能再活动。

  复发率:完全效应者随访5~7年大多数疗效稳定,约有10~20%在一年内感染再活动。复发者多数是疗程不充分,如重复治疗仍有良好疗效。

  不良反应:多数病人在第一次给药后出现畏寒、发热、肌肉疼痛、乏力、食欲减退,多在1~2周内逐渐减轻,少数有情绪改变,较微脱发。IFN有骨髓抑制作用,25~30%病人可出现白细胞、血小板、网织红细胞减少。以上不良反应停药后短期内可恢复。

  拉米呋啶治疗乙型肝炎

  拉米夫定是一种核苷类似物,具有活性的拉米呋啶的5-三磷酸代谢产物有两种抑制病毒的方式:①模拟三磷酸脱氧胞密啶而整合入新合成的HBV DNA,使DNA链的合成终止;②竞争性抑制病毒的DNA依赖性DNA多聚酶和RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)的活性,因此,拉米呋啶可以在HBV复制的四个阶段起作用:由前基因组mRNA向初生的负链DNA逆转录;以负链DNA为模板合成正链DNA;双链DNA和共价闭合环状DNA(cccDNA)的形成。

  根据一项以拉米呋啶持续4年治疗的观察结果,HbeAg阴转达73%,尤其治疗前ALT水平在正常上限2倍以上者效果更佳,对其中出现HbeAg阴转的病例停药后21个月随访有86%病人保持HbeAg(-),81人保持抗Hbe(+),这组病例停药时没有1例HbsAg阴转,但有9例在随访中出现HbsAg阴转,抗HBs(+)。

  YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)序列变异可导致拉米呋啶抑制病毒的作用减弱(基因型耐药),但YMDD变异株的复制能力也降低。对这类患者治疗观察无论是ALT或HBV DNA浓度,均比治疗前低,说明拉米呋啶对变异株的治疗仍有效。

  适应对象:年龄16岁以上,符合下列条件:

  ①HbeAg(+),HBV DNA(+)(有条件者可作HBV DNA定量测定),没有条件检测HBV DNA者可以HbeAg(+)为标准。

   ②HbeAg(—),抗—Hbe(+),HBV DNA(+),考虑有前C区变异,但也适合于治疗。

   ③ALT高于正常,胆红素低于50u mol/L(30mg/L)。

  研究观察对象:

  ①12~16岁慢性乙肝患者,具有病毒复制指标阳性及血清ALT升高。

   ②代偿期肝硬化伴有病毒复制者。

   ③无症状HBV携带者(尤其是肝活检发现有肝炎证据者),伴有活动性病毒复制或有肝癌家族史,偶尔有过肝功能不正常者。

  不适应治疗对象:

  ① 自身免疫性肝病。

   ② 遗传性肝病。

   ③ 脊髓抑制:血红蛋白<10g/L、白细胞<4×109/L、血小板<80×109/L。

   ④ 有明显心、脑、神经精神病和不稳定的糖尿病。

   ⑤ 妊娠妇女。

  注意事项:

  ① 合并HCV、HDV感染者效果不佳。

   ② 酗酒者在用药前先要戒酒。

   ③ 吸毒者用药前应严格戒毒。

   ④ 急性肝炎一般不用本药。

   ⑤ 哺乳期妇女应用时应充分考虑对母亲治疗的益处是否超过对婴儿的危害。

   ⑥ 肾功能减退者,应按血肌肝清除率调整剂量。

  剂量:100mg,每天1次口服。

   疗程:1~4年。

  停药标准:

   ① 治疗一年无效者。

   ② 治疗期发生严重有不良反应者。

   ③ 治疗期间合并妊娠者。

   ④ 出现病毒变异和耐药性,伴有临床恶化者。

   ⑤ 病人依从性差,不能坚持服药者。

  停药后继续随访观察6~12个月,每3个月复查HBV DNA、HbeAg、ALT、AST。

  联合用药:

  胸腺肽α1,中药等联合应用似乎有一定好处,与α干扰素合用效果不满意。

  目前最有希望联合应用于乙肝治疗的新药正处于研究阶段,如阿地弗韦、恩替卡韦等对病毒复制过程与逆转录酶有关的药物。

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责任编辑:战胜乙肝网

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