卫生部临床检验中心---李金明
乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝病毒科,具有明显的种属及嗜肝特性(尽管其亦可感染肝以外的组织、器官或细胞,如脾、辜丸、人外周血单个核细胞等),可致持续性病毒感染。我国在世界上属于乙型肝炎病毒感染的高发区,乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的携带者己超过10%,通常判断mv感染及其状况的指标为HBV的血清学标志物,如HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗mc(即所谓的"两对半")、抗HBc IgM和HBV DNA等,了解这些指标在什么情况下出现及其临床意义,对于我们检验工作者来说,亦具有重要意义。
1. 机体对HBV感染的免疫应答
机体感染HBV后,HBV的包膜和核壳抗原作为外来抗原物质可激发机体产生针对其的细胞和体液免疫应答。细胞免疫应答通过T细胞膜上抗原受体复合体的α自异二聚体识别经抗原提呈细胞处理的与HLA分子结合的病毒抗原短肤进行,而体液免疫应答是基于B细胞表面的免疫球蛋白受体特异识别原始的未经处理的分泌型或结构型病毒抗原,且根据在抗原结合中是否需要T细胞辅助,又分为T细胞依赖性和T细胞非依赖性两种方式。
1.1.细胞免疫应答
机体对HBV感染的细胞免疫应答包括HLKII和I类限制性T细胞应答。HBV的包膜抗原和核壳抗原均可激发机体的川一个或多个表位的HLA一II类限制性CD4+和I类限制性CD8+T 细胞应答。机体感染HBV后,最早出现的对HBV的T细胞免疫应答针对的是HBV的核壳抗原(HBcAg),且反应强烈,相对来说,针对mv包膜抗原(HBsAg等)的T细胞应答则要弱得多。一般认为,对HBV核壳抗原的这种强烈的HLA-II类限制性T细胞应答与病毒的清除有重要关系。其机制主要是通过诱导病毒特异的细胞毒T淋巴细胞(CTL)作用及通过旁路机制辅助HBV包膜特异性的B细胞产生抗ms中和抗体。后者在急性乙型肝炎的抗HBs的产生中具有重要作用,因为在急性乙肝时,针对msAg的HLA一II类限制性T细胞应答很弱。在慢性HBV感染,外周血中针对所有HBV抗原的T细胞应答与急性肝炎时相比较明显要弱,肝组织中可检测到有T细胞应答,但应答率亦较低。当慢性肝炎出现急性发作时,随着病毒复制活跃,血循环中HBV DNA和HbeAg大量增加,机体针对病毒衣壳的特异性T细胞反应出现增强,但此时由于HbsAg浓度无明显变化,针对病毒包膜抗原的T细胞仍较弱。这表明针对病毒核衣壳的II类限制性TE细胞应答可能依赖于衣壳抗原一定阙水平的表达,而病毒包膜特异性的T细胞应答由于持续高水平的HBsAg的存在受到抑制。
急性自限性乙型肝炎患者体内存在强烈的针对HBV包膜、衣壳及多聚酶的多个表位的多克隆性HLA-I类限制的细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答。目前已确定的CTL表位大多为HLA-A2限制的。不同患者的CTL应答所识别的病毒抗原表位有所不同,大多数都可识别核心18~27,包膜183~191,250~258,335~343和多聚酶455~463的表位,少数识别其它表位,说明对HBV的CTL的反应有个体差异。到目前为止,在核衣壳抗原上只发现了一个HLA-A2限制的CTL表位,而HBV包膜抗原中有11个识别表位,多聚酶有5个,与II类限制性CD4+T细胞应答正好相反。所产生的针对病毒包膜抗原的强烈的CTL反应可能与包膜抗原的强亲水性有关。一些CTL识别表位常常位于与病毒特异性功能有关的病毒氨基酸序列中。如核衣壳141~151位点与HBcAg定位于胞核以及mv基因包装信号有关,该位点同时又是HLA-A51和HLA-AW68限制的CTL的识别表位:又如HBV包膜250~269位点与HBsAg跨膜有关,同时又是HLA-A2限制的细胞表位。CTL识别表位与病毒特异性功能相关序列一致的现象在机体抗病毒免疫中具有重要意义,因为如果病毒的这些CTL识别表位在机体的免疫压力下发生变异从而逃避免疫清除,这种变异也势必影响病毒的生活周期。急性HBV感染者对HBV所有抗原均有强烈的CTL反应,而慢性持续感染者常常仅呈现微弱的甚或检测不到的病毒特异CTL反应。
1.2. 体液免疫应答
对HBV包膜抗原的体液免疫应答是T细胞依赖的。由于抗HBV包膜抗原的抗体通常是在急性肝炎恢复期或病毒己清除的病人中检出,而在慢性HBV感染者中呈阴性,故认为其与循环中的病毒清除有关。其机理可能是通过这种抗体与游离病毒颗粒形成复合物或阴断病毒侵入肝细胞而实现。可见抗HBs是具有保护作用的抗体。HBcAg刺激机体产生抗HBc可通过T细胞依赖和非依赖两条途径,这是因为HBcAg可直接结合或交叉联结于B淋巴细胞表面的抗原受体上激发免疫应答,从而无需T淋巴细胞的辅助作用。而HBeAg刺激机体产生抗me则必须有T淋巴细胞的辅助作用。在T细胞水平,HBcAg和HBeAg有高度的交叉反应性,说明T细胞无需蛋白构型来保存其抗原结合部位。在HBV感染时,产生抗HBc和抗HBe的应答应是相互独立的,由于T细胞对HBcAg和HBeAg交叉识别,抗体应答的差别源于B细胞水平。由于抗HBc的产生有T细胞依赖和非依赖两条途径,因而HBV感染者多能产生高滴度的抗HBc。HBV感染的急性期以IgM为主,亦有IgA类,这两种抗体的共同特征是均为由J链联接的多聚体,可能是急性病原体感染以出现这种大分子量抗体为主的共同特性。慢性期以IgG为主。抗ifBe出现较抗HBc晚。一般认为针对HBdg的体液免疫应答对HBV感染无保护作用,但动物实验表明被动注入抗HBe对黑猩猩有保护作用。乙肝患者出现e系统自然转换时,常出现一系列免疫功能改变,包括一过性的抑制性T细胞功能低下及HLA表达和干扰素产生减少,血清免疫复合物阳性等,e抗体出现后恢复。
2. 乙型肝炎病毒感染血清标志物的临床意义
2.1.乙型肝炎表面抗原(HBsAg)
HBsAg于1963年由Blumberg在澳大利亚土著人血中发现,称为澳大利亚抗原(即以前所谓的”澳抗”),后又称为肝炎相关抗原(HAA),1974年正式定名为乙型肝炎表面抗原(Hapetitis B Surface Antigen,简称为HBsAg),存在于HBv的外壳部分。HBsAg的抗原性较复杂,有一个特异的共同抗原决定族"a”和致少两个亚型决定簇"d/y"和"w/r",最常见的血清型为adw、adz和ayw。我国绝大多数地区以adr为主,adw次之(于长江以南诸省与adz-混存):新疆、西藏、内蒙古自治区的本地民族几乎全为ayw。血清中检出HBsAg是乙型肝炎的早期诊断指标之一,出现于患者血清ALT升高前2-8周,至恢复期HBsAg滴度逐步降低乃至消失,抗HBs出现,但有部分患者HBsAg在血清中可持续存在,原因可能是编码HBsAg的HBV的s区段和肝细胞人DNA整合,在这种情况下,即使HBV己从人体内消除,肝细胞仍能不断地复制HBsAg。
HBV感染后,大部分人没有临床表现,但在血中可检出HBsAg,这类人通常称为HBsAg携带者,在我国这类人超过1亿,其中大部分将持续携带HBsAg数年、数十年乃至终身而无临床症状,小部分人在平衡被打破后,可发展为急性或慢性乙型肝炎,甚至肝硬化、肝癌。
HBv感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg,含量在5ng~600μg/m1之间。据文献报道,到目前为止在献血员中所发现的HBsAg携带者最低含量为0.2ng/ml。我们发现含量高者可达2000μg/ml以上。但有少部份mv感染者血清HBsAg测定为阴性,如暴发性乙型肝炎、HBV的S基因发生变异等。急性重症乙型肝炎,肝细胞中以合成HBcAg为主,很少或不合成HBsAg,从而使外周血中无HBsAg。HBV的前S/S基因编码HBsAg,构成病毒外膜,根据所带亚型决定簇的不同分为adw、adz、ayw和ayr。这些决定簇主要处于第124~147位氨基酸序列中,经半脱氨酸的二硫键作用形成两个环,第一环由124~137位氨基酸构成,第二个环由139~l47位氨基酸组成。a决定簇主要存在于第二个环上,此肤段高度保守,其中几个甚至单个氨基酸的变异就有重要的生物学意义,尤其是第124位和147位氨基酸的半脱氨酸被丝氨酸替代,将破坏构型的稳定性。第142位脯氨酸被异亮氨酸替代,形成的疏水链将妨碍肤环的转折。因而个别关键的氨基酸的替代变异,足以改变HBsAg的构型,从而改变其抗原特性。a决定簇具有很高的免疫原样,在HBV的自然感染或注射HBsAg疫苗可引起抗HBs应答。如S基因145密码子变异使得其原来的甘氨酸被精氨酸替代时,可致a决定簇的抗原性发生改变,使机体产生的抗体对变异株无作用,且可引起HBV感染患者血清中同时出现HBsAg和抗HBs。同时乙肝疫苗接种也不能有效预防此类变异病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的变异有自然变异和逃避免疫变异,变异可发生在多个部位,而且几处突变可同时存在,这些变异有助于病毒携带状态的持续存在。
HBsAg不仅存在于血液中,而且还存在于许多体液和分泌物中,如唾液、尿液、乳汁、精液等。
目前国内最常用的HBsAg免疫测定方法为酶联免疫吸附试验(ELISA),其次是放射免疫试验(RIA)。ELISA简单、方便、快速,测定下限进口试剂盒可达0.2ng/III1,国产试剂盒目前也能达到0.5ng/ml。RIA因其试剂半衰期短、废物难于处理等,使用己很受局限。血清HBsAg仅为HBV感染的标志.不反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱及预后。
2.2.抗HBs(HBsAg)
急性乙型肝炎病人处于恢复期后,随着HBsAg的逐步消失,血清中出现抗HBs,抗HBs是一种中和抗体,其能在体内存在相当长的时间,以HBsAg作为疫苗免疫机体产生的抗HBs,对HBV的感染具有保护性免疫作用。lOmlu/ml抗HBs为表明对HBV具有免疫力的临界水平.低于此值,说明免疫失败。接受乙肝疫苗接种者,体内血循环中除了抗HBs外,不应出现其它乙肝病毒感染血清免疫学标志物,如抗HBe、抗HBc等,一旦出现除抗HBs以外的标志物,则应视为既往HBV感染。
一般情况下,血清中抗HBs和HBsAg不同时存在,若同时检出,可能为抗HBs产生的早期,或属于不同亚型的HBV感染,或由HBv的S基因变异所致。
2.3.HBeAg
HBeAg为HBcAg的可溶性成份,两者约有75%共同的氨基酸序列,但二级结构不同,各有特异的抗原决定簇,因而在细胞水平其体液免疫应答是不同的。其在血清中的出现时间稍后于HBsAg,一般血清HBeAg阳性者,HBsAg亦为阳性。有研究表明,当乙肝病毒的前核心区发生点突变时,可使得HBeAg无法表达,表现为血清HBeAg或抗ffBe测定持续为阴性,但血清HBsAg或HBV DNA可表现为阳性。
HBeAg与病毒Dane颗粒、HBV DNA具有伴随关系,是HBV复制活跃的血清学指标,血清HBeAg阳性说明传染性强,急性乙肝病人血清HBeAg持续阳性3个月以上,则有疾病慢性化倾向。
2.4.抗Hbe
当血清HBeAg转阴后,可出现抗HBe.两者同时阳性较少见。抗HBe阳性说明病毒复制减少,传染性弱,但并非没有传染性。
抗HBe不是保护性抗体,这一点与抗HBs不同。
2.5.总抗fBc和抗HBc IgM
从机体对HBV抗原的免疫应答来看,最早出现的是对HBcAg的细胞免疫应答(HBcAg的免疫原性最强),随后才发生对HBcAg的体液免疫应答产生抗HBc,总抗HBc包括抗HBc IgM、IgA、IgG和IgE等。抗mc IgM可以说是机体感染HBV后在血液中最早出现的特异抗体,在肝炎的急性期呈高滴度,是判断急性乙型肝炎的重要指标,随着急性乙肝的恢复,抗HBc IgM滴度(以及抗HBc IgA)降低乃至消失,如持续高滴度,则常表明病人乙肝有慢性化倾向。研究表明在慢性活动性乙型肝炎患者血循环中,抗HBc IgM检出率及滴度亦较高,说明HBV在体内复制活跃,是传染性强的指标之一。抗HBc不是保护性抗体。抗HBc在血中呈低滴度且与抗HBs同时存在,是既往感染的标志。
2.6.HBV DNA
血中HBV DNA的存在是HBV感染最为直接,最为灵敏和最为特异的指标。HBV DNA检测方法目前在国内使用最广的是聚合酶链反应(PCR)。使用PCR检测血中HBV DNA,其临床治疗价值主要有:
(1)急性HBV感染的诊断。当机体感染HBV时,在外周血中HBV DNA的出现要早于其它血清学抗原抗体指标,并且只有HBV DNA存在才会引起感染,因此使用极为灵敏特异的PCR方法检测HBV DNA可为急性HBV感染提供直接证据。
(2)可用于筛选献血员,监测血制品的传染性、血源性乙肝疫苗的安全性以及乙肝治疗药物抑制病毒复制的效果。
(3)HBV DNA PCR检测结果与血清免疫学检测结果的综合评价:乙肝"两对半"或乙肝"六项"("两对半"加上抗HBc-IgM)的ELISA检测,是临床实验最常用来检测乙肝的方法,如何看待其检测结果与HBVDNA检测结果之间的关系,是临床医生以及患者最为关心的问题,关系到临床治疗方案的确定。
①与HBsAg检测结果的关系。在实践中,常遇到的问题是HBsAg ELISA测定结果与HBV DNA检测结果之间的不一致,有两种情况:一是HBsAg阴性而HBV DNA PCR测定阳性,二是HBsAg阳性但HBv DNA阴性。前者可能是因为HBsAg ELISA测定敏感性低,对极低浓度的HBsAg测不出,而PCR具有极高的灵敏度,HBV DNA含量即使很低(甚至低至数个分子),亦可检测出来:或HBsAg确己消失,但HBV DNA仍持续存在,病毒仍处于低水平复制状态:此外,在HBv初期感染时,也可能是有HBv DNA而无HBsAg。HBV DNA阴性才是HBV消除的明确指标。HBsAg阳性而HBV DNA阴性其原因一为血中HBv DNA虽然存在,但是在特定的PCR检测方法的下限以下,如有的PCR试剂灵敏度差,检测HBV DNA的下限仅至1000或100个拷贝。第二种可能为血中存在的HBsAg是由HBV DNA整合到人染色体与宿主基因共同表达所致,所以测不到血清中病毒DNL通常,HBSAg阳性血清,PCR检测HBV DNA的阳性率约为96%。肝组织活检样本mv DNA PCR检测阳性率为100%。
②与抗HBs的关系。HBV感染后至恢复期抗HBs阳性,血清HBV DNA PCR检测-般为阴性,少部分亦可机但肝组织HBv DNA PCR阳性率仍可高达77.3%说明HBV存在于肝脏中。
③与HBeAg、抗HBe和抗HBc的关系。HBeAg阳性血清,HBV DNA PCR检测几乎全为阳性:HBeAg阴性而抗HBe和抗HBC阳性者,血清HBV DNA PCR的阳性率采用电泳法检测产物仅市为30%,但使用核酸探针杂交方法检测产物,阳性率可高至80%.慢性乙肝患者外周单个核细胞甲HBV DNA PCR检测阳性率较高,是乙肝复发的一个主要原因。血清抗HBe阳性,说明病毒复制减弱,血中HBv DNA减少,但并未完全消失,因此PCR检测是评价传染性的最可靠的方法。
④ 疗效果和抗病毒药物的疗效评价。使用定量PCR测定血中HBV DNA的量在患者治疗中的变化,可以判断相应药物的疗效,从而有利于采取有效的治疗方案。
总而言之,HBV DNA的PCR检测是判断HBV感染的最为可靠的方法,不但可用于乙型肝炎病毒感染的早早诊断、以及诊断的明确和治疗效果的评价、预后等,而且是判断患者有无传染性的最直接指标。