HBV 病毒学和免疫学诊断进展（1）
--血清HBV DNA水平的临床应用
上海交通大学医学院瑞金医院感染科 陆志檬
世界肝炎日系列活动的开展，提高了全球公众对病毒性肝炎的认识水平。近年来，乙型肝炎病毒学和免疫学的研究水平也得到了很大提高，本报《消化·肝病周刊》特别邀请上海交通大学医学院瑞金医院感染科陆志檬教授担任特约主任编委，国内专家撰稿，向读者系统介绍HBV病毒学和免疫学诊断进展。本期D2-D3版介绍HBV DNA检测、HBeAg阴性相关乙肝病毒突变检测的临床意义。
通常乙型肝炎的诊断可通过检测血清乙肝表面抗原（HBsAg）加以肯定，近年来发展了标准化定量的HBV DNA 分析，可进一步确定乙型肝炎的病毒血症。此外还可通过HBV DNA水平分析疾病活动，预测发生肝细胞癌（HCC）的风险或肝脏疾病相关病死率，分析乙肝患者是否需要接受抗病毒治疗，评估和预测药物疗效、发生耐药的风险以及评估患者发生临床耐药的突发事件等。
预测疾病严重性和预后
慢乙肝患者主要可以分成二组：乙肝e抗原（HBeAg）阳性和HBeAg（-）。林德（Lindh）等的分析表明，HBeAg(+)患者中86%和HBeAg(-)患者中5%的病毒载量>107 copies/ml，提示HBeAg(+)患者较HBeAg(-)者HBV DNA载量更高。
研究还发现，在HBeAg(-)患者中，HBV DNA水平与组织学的关系较HBeAg(+)患者更强，但未见HBeAg(+)患者中HBV DNA水平与肝损伤的相关性，只是发现HBeAg(-)个体HBV DNA水平>2×105 copies/ml者较病毒载量更低的HBeAg(-)患者更易发生严重肝病。
研究发现，持续的病毒血症与肝脏疾病进展相关。除了HBV DNA水平，与慢性乙肝进展到肝硬化相关的其他因素包括：年龄较大，基因型C型和B型，丙氨酸氨基转移酶（ALT）周期性急性上升，进展性纤维化，酒精消耗量，合并感染HCV、HDV或HIV。
近期一项长期研究（平均随访11.4年）显示，高病毒载量与肝硬化的发生、失代偿肝硬化和HCC导致的死亡相关。在随访13年时，基线HBV DNA水平检测不到（<300 copies/ml）者HCC累积发生率为1.3%，≥1×106 copies/ml者为14.9%，提示HBV DNA持续存在是HCC发生的高危因素。
参加研究的患者来自癌症筛查中心，在入组后没有接受抗病毒治疗，因而他们代表了自然病史队列。HBV DNA水平与HCC发生的危险度和致死率的相关性独立于基线ALT、肝硬化和HBeAg血清状态，也未表明有短暂或持续的活动性肝炎会增加HCC的危险度。这些数据表明了抗病毒治疗的重要性。
HBV DNA水平与肝组织学
研究发现，不能通过HBV DNA水平区分肝脏轻度组织学异常与重度组织学异常。胡夫纳格尔（Hoofnagle）等评估了167例患者（1980－2003年）。结果显示，组织学活动指数（HAI）≥12（严重）时，HBV DNA的平均水平是8.4log10copies/ml；HAI为0-3（轻微）时，HBV DNA平均水平是7.7log10copies/ml。丙氨酸氨基转移酶（ALT）更适合预测组织活动度。综合考虑，以上结果提示，单纯检测HBV DNA或ALT不能精确描述疾病的炎症活动度。
HBV 在抗病毒治疗中的应用
治疗适应证
美国肝病研究学会（AASLD）指南及我国2006年《慢性乙肝防治指南》明确指出：HBeAg(+)慢性乙肝，若血清HBV DNA水平≥105 copies/ml，伴ALT升高或组织学活动，需要考虑抗病毒治疗。
HBeAg(-)慢性乙型肝炎HBV DNA水平为≥104 copies/ml伴ALT升高时也考虑治疗，若有疑问，可行肝活检加以判断，因此血清HBV DNA水平是决定是否需要抗病毒治疗的重要指标之一。
疗效评价
病毒学应答是评价疗效的主要指标。这是由于抗病毒治疗后病毒载量下降到104 copies/ml与ALT正常、HBeAg消失和血清转换相关，并可降低耐药风险。
在临床试验中，通常应用两个指标：①与基线相比，治疗结束时HBV DNA水平下降均值或中位数，通常以log10 copies/ml表示；②治疗结束和随访结束时HBV DNA水平下降至<1000 copies/ml或<300 copies/ml的百分比，分别被称为治疗结束时应答（ETR）和持续病毒学应答（SVR）。
治疗应答的评估与预测
HBeAg（＋）慢乙肝患者，基线HBV DNA低水平（＜5x107copies/ml）与持续病毒学应答相关；在干扰素治疗时，基线HBV DNA＜109copies/ml可预测高的血清HBeAg转换率。
核苷类药物的早期病毒学应答，在预测持续病毒学应答和低耐药发生率方面具有重要意义。元（Yuen）等的研究表明，拉米夫定（LAM）延迟治疗时发生HBV DNA突破的相关预测因素是治疗早期HBV DNA水平，若患者治疗6个月时血清HBV DNA水平＞200 IU/ml，可预测随后发生耐药的概率为63％。
最近研究表明，若4周时血清HBV DNA水平＜2000 IU/ml，可预测5年后的理想应答（血清HBV DNA水平＜400 IU/ml，HBeAg血清转换，ALT复常和无YMDD变异）。相似的研究结果提示，HBeAg（＋）患者接受替比夫定（LdT）治疗6个月时，血清HBV DNA水平达到检测水平以下（＜60 IU/ml），预测2年后HBeAg血清转换率为49%，ALT正常率为85%，持续病毒应答率为86%，耐药率仅为2%；在HBeAg（－）患者中也获得相似结果，治疗2年的ALT正常率为83%，持续病毒应答率为88%。
总之，在治疗中监测HBV DNA水平，可确定早期病毒学应答（在检测水平以下），并预测治疗应答和可能出现的耐药风险。
HBV DNA定量检测方法与标准化
测HBV DNA试剂，包括信号扩增试验和基于靶扩增的实时荧光PCR试验，其检测灵敏度及范围不完全相同，范围101～109copies/ml（表1）。为了使各种商业公司所生产试剂检测结果具有可比性，WHO专门设立了血清HBV DNA的标准单位，以IU/ml表示，若将copies/ml转换为IU/ml，一般可以以copies/ml÷5＝IU/ml计算。国内公司的检测范围为103-108 copies/ml，均经我国食品与药物管理局（SFDA）批准，与国外相比灵敏度较低，检测范围偏小。
（参考文献从略）
表1 国外商业化定量HBV DNA分析法的比较
HBV 病毒学和免疫学诊断进展（2）
--与HBeAg阴性相关的HBV突变
乙肝病毒e抗原（HBeAg）是乙型肝炎病毒（HBV）产生的重要抗原之一，虽然HBeAg并非病毒复制所必须，但核苷酸序列变异导致HBeAg低表达或不表达在疾病进展中的作用不容忽视。
HBeAg的免疫调节作用
HBeAg由HBV前C基因区 和C基因区共同编码，是一种非壳体化分泌形式的核心蛋白，它自肝细胞分泌，最终进入血液循环。HBeAg对于HBV感染和复制并非必不可少，它主要起到免疫调节作用，以帮助病毒建立持续性感染。HBeAg的免疫调节作用体现在，它可通过抑制HBV前基因组mRNA进入核衣壳的壳体化过程，对DNA复制进行负调控，最终使病毒抗原表达和呈递不易被T细胞发现。此外，作为一种免疫耐受原，它还可以弱化宿主针对病毒感染肝细胞的免疫应答作用。
在临床检测时，血清HBeAg阳性反映肝脏中HBV活跃复制，但HBeAg阴性则有两种可能：① 如果HBV慢性感染者的丙氨酸氨基转移酶（ALT）正常，且HBV DNA阴性，则HBeAg阴性提示为非活动性乙肝表面抗原（HBsAg）携带者；② 如ALT升高，且HBV DNA阳性，提示体内HBV可能发生突变，导致HBeAg阴性， 为HBeAg阴性慢性乙型肝炎（CHB）。
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与HBeAg阴性相关的HBV突变
最常见的导致HBeAg阴性的HBV突变有两类 ，一类是发生在基本核心启动子（BCP）区内的A1762T和（或）G1764A突变，使HBeAg表达水平降低，当血清HBeAg水平低于试剂检测下限时，即出现HBeAg阴性结果；另一类是发生在前C区的G1896A突变，导致第28位密码子上的色氨酸密码子（TGG）变为终止密码子（TAG），使HBeAg前体蛋白合成停止，血清HBeAg阴性。
在同一毒株上可发生A1762T、G1764A和（或）G1896A单位点突变、双位点或三位点联合突变。
与HBeAg阴性相关的HBV突变与HBV基因型有关。BCP双突变虽在A~D基因型中都能发现，但在基因型A和C中更为流行。G1896A突变见于B、D、E、G基因型和某些C基因型感染，但与基因型B和D的相关性更密切。因为我国最流行的HBV基因型是B型和C型，因此，与HBeAg阴性相关的HBV突变在我国HBeAg阴性CHB患者中流行率很高。
BCP和前C突变的检测方法
首先，BCP和前C突变与疾病的进程和预后有关。BCP和前C突变是导致HBeAg阴性CHB的原因之一，在亚洲，这种类型的HBeAg阴性CHB的临床表现已占主导地位。BCP区1762和1764位点突变在肝硬化 (LC) 和原发性肝细胞癌 （HCC）患者中检出率很高，在基因B型中，BCP突变已被认为是发生LC或HCC的危险因素之一。
但是，关于基因C型的研究结果差异较大，有的结果显示，C基因型BCP突变与疾病向终末期肝病方向发展有关，但也有报告显示，在非终末期肝病患者甚至非活动性肝病患者中，1762和1764位点突变的发生率也很高。这些相互矛盾的结果，反映了不同研究在实验设计和研究群体等方面的差异，尚需更多更严谨的研究加以澄清。
前C区G1896A突变多见于暴发性肝炎、慢性活动性肝炎、LC和HCC患者，但在无症状携带者中也可检出，其与终末期肝病的相关性目前尚未有定论，甚至有研究显示，此类突变可降低HCC发生的风险。进一步的研究需要排除基因型和BCP变异等混杂因素的影响。
其次，具有前C和（或）BCP变异的CHB患者可能是发生对某种核苷（酸）类似物耐药突变的高危人群。这是因为，这些突变可弥补一些耐药变异株在复制能力上的缺陷。体外研究表明，前C或BCP变异可增强rtA194T（替诺福韦耐药）突变株被减弱的复制能力。
BCP和前C突变检测的临床意义
目前检测BCP和前C区突变的工具既有商品化试剂，也有各个实验室自己建立的方法，主要原理是基于靶序列扩增、扩增产物杂交或直接测序。常用的商品化试剂有应用线性探针杂交技术的INNO-LiPA HBV PreCore试剂和基于聚合酶链反应（PCR）和微孔板模式的Affigene HBV Mutant VL19试剂等。
此外，PCR产物直接测序法应用也较为广泛，还有基因芯片法、寡核苷酸连接测定法（OLA）和特异性探针实时荧光PCR法等。测序法适用于检测优势毒株，杂交法及OLA法在检出小比例突变株时更为灵敏。
总之，目前人们对BCP和前C突变在HBV感染相关终末期肝病发展中的致病作用及其对抗病毒治疗的可能影响等方面的认识尚不全面和统一，因此，采用这些突变或突变组合的特点来指导临床实践的时机尚不成熟，需要更为深入和广泛的研究。期待在不远的将来，结合HBV基因型、前C和BCP突变等指标的检测，能为患者提供更优化的防治方案。
责任编辑 杜佳梅